JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Подготовка грибковых и растительных материалов для структурной разяснения, используя динамический ядерной поляризации твердотельного ЯМР

Published: February 12, 2019
doi:
10.3791/59152
, , , , ,
1Department of Chemistry,Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology,Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

Протокол для подготовки 13C,15N-меченых грибковых и растений образцов для многомерных твердотельного ЯМР спектроскопии и динамических ядерных поляризации (DNP) расследований представил.

Abstract

Этот протокол показывает, как равномерно 13C, 15N-меченых грибковых материалы могут быть произведены и как эти мягкие материалы должны быть продолженным для твердотельного ЯМР и повышенной чувствительности DNP экспериментов. Процедура обработки образца биомассы растений также подробно. Этот метод позволяет измерение серии 1D и 2D 13C –13C /15N корреляции спектры, которые позволяет с высоким разрешением структурных разъяснения сложных биоматериалов в их родном государстве, с минимальными возмущений. Изотоп маркировки может быть проверен количественного определения интенсивности в 1D спектров и эффективность переноса поляризации в спектрах 2D корреляции. Успех динамического ядерной поляризации (DNP) пробоподготовки может оцениваться на коэффициент повышения чувствительности. Дальнейшие эксперименты, структурные аспекты белки и полисахариды приведет к модели трехмерный архитектуры. Эти методы могут быть модифицировать и адаптировать для изучения широкого спектра материалов богатых углеводами, включая природные стенки клеток растений, грибов, водорослей и бактерий, а также синтезируется или углеводов полимеров и их комплекс с другими молекул.

Introduction

Углеводы играть центральную роль в различных биологических процессах, таких как хранение энергии, структурной здание и клеточных признание и адгезии. Они обогащаются в клеточной стенки, который является основным компонентом в растений, грибов, водорослей и бактерий в1,2,3. Стены клетки служит центральным источником для производства биотоплива и биоматериалов, а также перспективные цели для антибактериальной терапии4,5,6,,78 , 9.

Современного понимания этих сложных материалов существенно продвинулась в течение десятилетий усилия, которые были посвящены структурных характеристик, используя четыре основных биохимических и генетических методов. Первый основной метод опирается на последовательные процедуры с использованием агрессивных химикатов или ферменты сломать стены клетки на различные части, которые следуют композиционные и связь анализ сахара в каждой фракции10. Этот метод проливает свет на домен распределения полимеров, но толкование может ввести в заблуждение из-за физических и химических свойств биомолекул. Например трудно определить ли щелочно извлекаемая часть происходит от одного домена менее структурированные молекул или пространственно разделенных молекул с сопоставимыми растворимость. Во-вторых, извлеченные части или всей клеточной стенки также может быть измерена с помощью решения ЯМР для определения ковалентных связей, также называются сшивки, между различными молекулами11,12,13, 14,15. Таким образом может быть исследован Подробная структура ковалентных якорей, но могут существовать ограничения из-за низкой растворимости полисахаридов, относительно небольшое количество сайтов сшивки и невежество non ковалентные эффектов, что стабилизирует полисахарид упаковка, включая водород склеивание, Ван дер Ваальса силы, электростатического взаимодействия и полимерные запутанности. В-третьих был сродство определяется в пробирке с помощью изолированных полисахариды16,,1718,19, но очистки, которые могут существенно изменить процедуры Структура и свойства этих биомолекул. Этот метод также не удается реплицировать сложные осаждения и Ассамблеи макромолекул после биосинтеза. Наконец фенотип, морфологию клеток и механических свойств генетических мутантов с ослабленной производства некоторых компонентов клеточной стенки пролить свет на структурных функций полисахаридов, но более Молекулярные доказательства необходимы для преодоления этих макроскопические наблюдения с функцией инженерии белка механизмов20.

Последние достижения в разработке и применении многомерных твердотельного ЯМР спектроскопии ввели уникальную возможность для решения этих структурных головоломок. 2D/3D твердотельного ЯМР эксперименты позволяют разрешением исследование состава и архитектуре богатых углеводами материалов в родном государстве без крупных возмущений. Структурные исследования были успешно проведены на начальных и средних клеточной стенки растений, каталитически обработанной биомассы, бактериальные биопленки, пигмент призраков в грибов и, недавно, авторы, нетронутыми клеточной стенки в патогенных грибов Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. Разработка динамических ядерной поляризации (DNP)32,33,34,,3536,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 существенно облегчает выяснение структурной ЯМР как повышение чувствительности, DNP заметно сокращает экспериментальной время на эти сложные биоматериалов. Протокол, описанные здесь подробности процедуры изотоп маркировки гриб A. fumigatus и подготовке грибковых и образцы растений для твердотельного ЯМР и ДНП характеристику. Аналогичные процедуры маркировки должны быть применимы для других грибов с измененной среднего, и процедуры подготовки образца должны быть вообще применимы для других богатых углеводами биоматериалов.

Protocol

1. рост 13C, 15N-меченых Aspergillus fumigatus жидкой среды Подготовка немеченого и 13C, 15N-меченых роста среднегоПримечание: Оба дрожжевой экстракт Пептон Декстроза среднего (YPD) и улучшенная минимальный средний43 использовались для поддержания грибков…

Representative Results

Изотоп маркировки существенно повышает чувствительность ЯМР и делает возможным для измерения серии 2D 13C -13C и 13C -15N корреляции спектры для анализа состава, гидратации, мобильность и упаковка Полимеры, которые будут интегрированы построить трехм…

Discussion

По сравнению с биохимическими методами, твердотельного ЯМР имеет преимущества как метод неразрушающего и высоким разрешением. NMR также количественные композиционного анализа, и в отличие от большинства других аналитических методов, делает не имеют неопределенности представлен огран…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальный научный фонд через NSF OIA-1833040. Национальная Лаборатория высоких магнитного поля (NHMFL) поддерживается Национальный научный фонд через терминал DMR-1157490 и штата Флорида. MAS-DNP системы в NHMFL частично финансируется NIH S10 OD018519 и NSF CHE-1229170.

Materials

Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
  2. Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol – Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
  9. Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
  10. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  11. Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
  12. Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
  13. Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
  14. Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall – the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
  15. Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall – beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
  16. Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
  17. Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks – Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
  18. Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
  19. Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
  20. Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435 (2013).
  21. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  22. Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
  23. Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
  24. Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902 (2016).
  25. Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
  26. Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
  27. Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
  28. Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
  29. Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747 (2018).
  30. Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
  31. Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
  32. Mentink-Vigier, F., Akbey, &. #. 2. 2. 0. ;., Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
  33. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  34. Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
  35. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  36. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  37. Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
  38. Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
  39. Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
  40. Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
  41. Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
  42. Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
  43. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
  44. Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
  45. Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
  46. Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
  47. White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
  48. Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
  49. Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
  50. Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
  51. Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
  52. Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
  53. Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
  54. Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
  55. Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
  56. Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , (2019).
  57. Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin’s target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
  58. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  59. Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
  60. Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347 (2019).
  61. Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

Tags

Fungal MaterialsPlant MaterialsSolid-state NMRDynamic Nuclear PolarizationBiomaterialsCarbohydratesFungal Cell WallsCell CultureYPD MediumLabeled Minimal MediumIsotope LabelingCarbon-13Nitrogen-15SterilizationAutoclaveCell Culture Techniques

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image