Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State

Hidratos de carbono desempenham um papel central em vários processos biológicos, tais como armazenamento de energia, construção estrutural e reconhecimento celular e adesão. Eles são enriquecidos na parede celular, que é um componente fundamental em plantas, fungos, algas e bactérias^1,2,3. Parede celular serve como uma fonte central para a produção de biocombustível e biomateriais, bem como um alvo promissor para terapias antimicrobiana^{4,5,6,7,8 , 9}.

A compreensão contemporânea destes materiais complexos tem sido substancialmente avançada por décadas de esforços que foram dedicados à caracterização estrutural usando quatro principais métodos bioquímicos ou genéticos. O primeiro método principal se baseia em tratamentos sequenciais usando produtos químicos ou enzimas para quebrar as paredes celulares em porções diferentes, que é seguido por composição e análise de enlace de açúcares em cada fração de¹⁰. Este método lança luz sobre a distribuição de domínio de polímeros, mas a interpretação pode ser enganosa devido às propriedades físicas e químicas das biomoléculas. Por exemplo, é difícil determinar se a fração alcaloide extraíveis origina-se de um único domínio de moléculas menos estruturadas ou de moléculas espacialmente separadas com solubilidade comparável. Em segundo lugar, a porções extraídas ou paredes de célula inteira pode também ser medidas usando solução NMR para determinar as ligações covalentes, também denominadas como reticulação, entre diferentes moléculas^{11,12,13, 14,15}. Desta forma, a estrutura detalhada das ligações covalentes âncoras poderia ser sondada, mas limitações podem existir devido a baixa solubilidade de polissacarídeos, o número relativamente pequeno de sites de reticulação e a ignorância dos efeitos não-covalente que estabiliza embalagem de polissacarídeo, incluindo a ligação do hidrogênio, força de van der Waals, interação eletrostática e entrelaçamento de polímero. Em terceiro lugar, a afinidade obrigatória tem sido determinada em vitro usando polissacarídeos isolados^16,17,18,19, mas a purificação procedimentos podem alterar substancialmente a estrutura e propriedades destas biomoléculas. Esse método também não consegue replicar a deposição sofisticada e montagem de macromoléculas após a biossíntese. Finalmente, o fenótipo, morfologia celular e propriedades mecânicas dos mutantes genéticos com produção atenuada de determinado componente da parede celular lançar luzes sobre as funções estruturais dos polissacarídeos, mas evidências moleculares mais é necessário para colmatar estas observações macroscópicas com a função engenharia de proteína machineries²⁰.

Recentes avanços no desenvolvimento e aplicação de espectroscopia NMR Solid-State multidimensional introduziram uma oportunidade única para resolver estes enigmas estruturais. 2D/3D Solid-State NMR experimentos permitem investigação high-resolution da composição e arquitetura de materiais ricos em carboidratos no estado nativo, sem grandes perturbações. Estudos estruturais têm sido realizados com sucesso no primário e paredes celulares secundárias de plantas, a biomassa tratada cataliticamente, biofilme bacteriano, o pigmento fantasmas em fungos e, recentemente pelos autores, as paredes celulares intactos em um fungo patogênico Aspergillus fumigatus ^{21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31}. o desenvolvimento da polarização nuclear dinâmica (DNP)^{32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42} substancialmente facilita a elucidação estrutural de NMR como o aprimoramento da sensibilidade pela DNP marcadamente encurta o tempo experimental em biomateriais estes complexos. O protocolo descrito aqui detalha os procedimentos para o fungo a. fumigatus isótopo-rotulagem e preparando fúngicas e amostras da planta para a caracterização do estado sólida NMR e DNP. Procedimentos de rotulagem semelhantes devem ser aplicáveis a outros fungos com meio alterado, e os procedimentos de preparação de amostra devem ser geralmente aplicáveis a outros biomateriais ricos em carboidratos.