Summary

Preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare NMR allo stato solido

Published: February 12, 2019
doi:

Summary

Un protocollo per la preparazione 13C,15campioni fungini e vegetali N-etichettati per spettroscopia NMR allo stato solido multidimensionale e indagini di polarizzazione nucleare dinamica (DNP) è presentato.

Abstract

Questo protocollo viene illustrato come uniformemente 13C, 15N-labeled fungine materiali possono essere prodotta e come questi materiali morbidi dovrebbero essere proceduti per NMR allo stato solido e sensibilità avanzata DNP esperimenti. La procedura di elaborazione del campione di biomassa vegetale è anche dettagliata. Questo metodo consente la misurazione di una serie di 1D e 2D 13C –13C / gli spettri di correlazioni15N, che consente ad alta risoluzione delucidazione strutturale dei complessi biomateriali nel loro stato nativo, con minima perturbazione. L’isotopo-etichettatura può essere esaminato da quantificare l’intensità negli spettri di 1D e l’efficienza del trasferimento di polarizzazione negli spettri di correlazione 2D. Il successo della preparazione del campione di polarizzazione nucleare dinamica (DNP) possa essere valutato per il fattore di aumento di sensibilità. Ulteriori esperimenti esaminando gli aspetti strutturali del polisaccaridi e proteine porterà ad un modello dell’architettura tridimensionale. Questi metodi possono essere modificati e adattati per studiare una vasta gamma di materiali ricchi di carboidrati, tra cui le pareti della cellula naturale di piante, funghi, alghe e batteri, così come sintetizzato o progettato carboidrati polimeri e il loro complesso con altri molecole.

Introduction

Carboidrati svolgono un ruolo centrale in vari processi biologici come stoccaggio di energia, costruzione strutturale e riconoscimento cellulare e adesione. Sono arricchiti nella parete delle cellule, che è un componente fondamentale in piante, funghi, alghe e batteri1,2,3. La parete cellulare funge da una fonte centrale per la produzione di biocombustibili e biomateriali, come pure un bersaglio promettente per terapie antimicrobiche4,5,6,7,8 , 9.

La moderna comprensione di questi materiali complessi è stato sostanzialmente avanzata da decenni di sforzi che sono stati dedicati alla caratterizzazione strutturale utilizzando quattro principali metodi biochimici o genetici. Il primo metodo principale si basa su trattamenti sequenziali utilizzando sostanze chimiche aggressive o enzimi per abbattere i muri della cella in diverse porzioni, che è seguita da compositivo e analisi di linkage di zuccheri in ogni frazione10. Questo metodo mette in luce la distribuzione di dominio dei polimeri, ma l’interpretazione può essere fuorviante a causa delle proprietà chimiche e fisiche di biomolecole. Ad esempio, è difficile determinare se la frazione di alcali-estraibile ha origine da un singolo dominio di molecole meno strutturati o da molecole nello spazio separate con solubilità paragonabile. In secondo luogo, le porzioni estratte o intere pareti della cellula può anche essere misurate utilizzando soluzione NMR per determinare i legami covalenti, anche definiti come reticolazione, tra molecole diverse11,12,13, 14,15. In questo modo, potrebbe essere sondata la struttura dettagliata delle ancore covalente, ma possono esistere limitazioni a causa della bassa solubilità di polisaccaridi, il numero relativamente piccolo di reticolazione siti e l’ignoranza degli effetti non-covalente che stabilizza imballaggio di polisaccaride, inclusi legami a idrogeno, forza di van der Waals, interazione elettrostatica e dell’intrico di polimero. In terzo luogo, l’affinità di legame è stata determinata in vitro utilizzando polisaccaridi isolato16,17,18,19, ma la purificazione delle procedure possono alterare sostanzialmente la struttura e le proprietà di queste biomolecole. Questo metodo inoltre non riesce a replicare la deposizione sofisticato e l’assemblaggio di macromolecole dopo biosintesi. Infine, il fenotipo, morfologia delle cellule e proprietà meccaniche dei mutanti genetici con produzione attenuato di certo componente della parete cellulare capannone luci sulle funzioni strutturali di polisaccaridi, ma prova più molecolare è necessaria per colmare questi osservazioni macroscopiche con la funzione ingegnerizzata di proteina macchinari20.

Recenti progressi nello sviluppo e applicazione della spettroscopia NMR allo stato solido multidimensionale hanno introdotto un’occasione unica per risolvere questi enigmi strutturali. Indagini ad alta risoluzione della composizione e architettura di materiali ricchi di carboidrati nello stato nativo senza perturbazione principali abilitare esperimenti NMR allo stato solido 2D/3D. Studi strutturali sono stati condotti con successo sia primaria e pareti di cella secondaria delle piante, la biomassa cataliticamente trattata, biofilm batterico, il pigmento fantasmi in funghi e, di recente dagli autori, le pareti della cellula intatte in un fungo patogeno Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. lo sviluppo di polarizzazione nucleare dinamica (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 facilita sostanzialmente delucidazione strutturale NMR in quanto l’aumento di sensibilità di DNP contrassegnato riduce il tempo sperimentale su questi biomateriali complessi. Il protocollo descritto qui i dettagli le procedure per la marcatura a isotopi del fungo a. fumigatus e preparando fungine e campioni di piante per la caratterizzazione NMR e DNP a stato solido. Procedure di etichettatura simili dovrebbero essere applicabile ad altri funghi con alterato medio, e le procedure di preparazione del campione dovrebbero essere generalmente applicabile ad altri biomateriali ricchi di carboidrati.

Protocol

1. crescita di 13C, 15N-labeled fumigatus dell’aspergillo mezzo liquido Preparazione di adenoide e 13C, 15N-labeled crescita medioNota: Entrambi mezzo lievito estrarre Peptone destrosio (YPD) e il miglioramento medio minimo43 sono stati utilizzati per il mantenimento della coltura fungosa. Tutti i passaggi dopo la sterilizzazione in autoclave sono eseguiti in una cappa a flusso laminare per minimizzare la contaminazione. Pr…

Representative Results

La marcatura a isotopi sostanzialmente aumenta la sensibilità di NMR e rende possibile per una serie di 13C -15N correlazione spettri per analizzare la composizione, l’idratazione, la mobilità e 2D 13C -13C di misura e l’imballaggio di polimeri, che saranno integrati per costruire un modello tridimensionale dell’architettura della parete cellulare (Figura 1). Se l’etichettatura uniforme ha esito positivo, un set c…

Discussion

Confrontato con i metodi biochimici, NMR allo stato solido ha vantaggi come una tecnica non distruttiva e ad alta risoluzione. NMR è anche in analisi della composizione quantitativa, e a differenza di molti altri metodi analitici, fa non sono le incertezze introdotte dalla solubilità limitata dei biopolimeri. Istituzione dell’attuale protocollo facilita gli studi futuri su biomateriali ricchi di carboidrati e polimeri funzionalizzati. Tuttavia, dovrebbe essere notato che l’analisi di dati e di assegnazione di risonanza…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation attraverso NSF OIA-1833040. Il laboratorio nazionale di campo magnetico alta (NHMFL) è supportata dalla National Science Foundation attraverso DMR-1157490 e dello stato della Florida. Il sistema di MAS-DNP presso NHMFL è in parte finanziato dal NIH S10 OD018519 e NSF CHE-1229170.

Materials

Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia

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Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).

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