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Biochemistry

Vorbereitung von Pilz und Pflanze-Materialien für strukturelle Aufklärung mittels dynamischen atomare Polarisation Festkörper-NMR

Published: February 12, 2019
doi:
10.3791/59152
, , , , ,
1Department of Chemistry,Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology,Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

Ein Protokoll für die Probenvorbereitung 13C,15N-Label Pilz und Pflanze für multidimensionale Festkörper-NMR-Spektroskopie und dynamische atomare Polarisation (DNP) Untersuchungen wird vorgestellt.

Abstract

Dieses Protokoll zeigt, wie einheitlich 13C, 15N-Label Pilz Materialien können produziert und Experimente wie diese weichen Materialien für Festkörper-NMR und erhöhter Empfindlichkeit DNP vorgegangen werden sollte. Die Probenverarbeitung Verfahren der pflanzlichen Biomasse wird auch genau beschrieben. Diese Methode ermöglicht die Messung von einer Reihe von 1D und 2D 13C –13C /15N Korrelationen Spektren, die hochauflösende strukturelle Aufklärung von komplexen Biomaterialien in ihrem nativen Zustand mit minimaler Störung ermöglicht. Die Isotopen-Kennzeichnung kann durch Quantifizierung der Intensität in 1D-Spektren und die Polarisation Auftragswirkungsgrad in 2D Korrelation Spektren untersucht werden. Der Erfolg der Probenvorbereitung dynamische atomare Polarisation (DNP) kann von der Empfindlichkeit Verstärkung Faktor ausgewertet werden. Weitere Experimente untersuchen die strukturellen Aspekte der Polysaccharide und Proteine führt zu einem Modell für die dreidimensionale Architektur. Diese Methoden können geändert und angepasst, um eine Vielzahl von Kohlenhydrat-reiche Materialien, einschließlich der natürlichen Zellwände von Pflanzen, Pilzen, Algen und Bakterien, sowie synthetisiert oder konzipiert Kohlenhydrat-Polymere und ihre komplex miteinander zu nehmen Moleküle.

Introduction

Kohlenhydrate spielen eine zentrale Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen wie Energiespeicher, strukturelle Gebäude und zelluläre Anerkennung und Haftung. Sie sind in der Zellwand, bereichert die ist ein elementarer Bestandteil in Pflanzen, Pilze, Algen und Bakterien1,2,3. Die Zellwand dient als zentrale Quelle für die Produktion von Biokraftstoffen und Biomaterialien sowie ein viel versprechendes Ziel für antimikrobielle Therapien4,5,6,7,8 , 9.

Das gegenwärtige Verständnis dieser komplexen Materialien wurde im Wesentlichen durch jahrzehntelange Bemühungen vorgebracht worden, die die strukturelle Charakterisierung mit vier wichtigen biochemischen und genetischen Methoden gewidmet waren. Die erste wichtige Methode stützt sich auf sequenzielle Behandlungen mit ätzenden Chemikalien oder Enzyme um zu brechen die Zellwände in verschiedenen Portionen, gefolgt von kompositorischen und Kopplungsanalyse von Zucker in jedem Bruchteil10. Diese Methode gibt Aufschluss über die Domäne Verteilung von Polymeren kann, die Auslegung jedoch aufgrund der chemischen und physikalischen Eigenschaften von Biomolekülen irreführend. Zum Beispiel ist es schwierig, festzustellen, ob der Alkali-extrahierbare Anteil aus einer einzelnen Domäne weniger strukturierten Moleküle oder räumlich voneinander getrennten Moleküle mit vergleichbaren Löslichkeit stammt. Zweitens die entnommenen Teile oder ganze Zellwände auch gemessen werden mit NMR-Lösung um zu bestimmen, die kovalenten Verbindungen, auch bezeichnet als Vernetzung zwischen verschiedenen Molekülen11,12,13, 14,15. Auf diese Weise könnte die detaillierte Struktur der kovalente Anker sondiert werden, aber Einschränkungen möglicherweise vorhanden, durch die geringe Löslichkeit von Polysacchariden, die relativ kleine Anzahl von Standorten Vernetzung und die Unkenntnis der nicht-kovalente Effekte, die stabilisiert Polysaccharid-Verpackung, einschließlich Wasserstoff-Bindung, Van-Der-Waals-Kraft, elektrostatische Wechselwirkung und Polymer Verschränkung. Drittens wurde die Bindungsaffinität entschlossen in Vitro mit isolierten Polysaccharide16,17,18,19, aber die Reinigung, das Verfahren erheblich verändern kann die Struktur und die Eigenschaften dieser Biomoleküle. Diese Methode wird auch nicht die anspruchsvolle Anlagerung und Montage von Makromolekülen nach Biosynthese zu replizieren. Schließlich den Phänotyp, Zellmorphologie und mechanischen Eigenschaften von genetische Mutanten mit attenuierten Produktion bestimmten Zellwand-Komponente vergossen Lichter auf die strukturellen Funktionen von Polysacchariden, aber mehr molekularen Nachweis ist erforderlich, um diese zu überbrücken makroskopische Beobachtungen mit der technischen Funktion des Proteins Maschinen20.

Jüngste Fortschritte in der Entwicklung und Anwendung der multidimensionalen Festkörper-NMR-Spektroskopie haben eine einzigartige Gelegenheit für diese strukturellen Rätsel eingeführt. 2D/3D Festkörper-NMR-Experimente ermöglichen hochauflösenden Untersuchung der Zusammensetzung und Architektur der Kohlenhydrat-reiche Materialien im nativen Zustand ohne große Störung. Strukturelle Studien wurden erfolgreich durchgeführt, auf primären und sekundären Zellwände von Pflanzen, die katalytisch behandelten Biomasse bakterielle Biofilm, das Pigment Geister in Pilzen und vor kurzem von den Autoren, die intakte Zellwände in ein pathogener Pilz Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. die Entwicklung der dynamischen atomare Polarisation (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 erleichtert wesentlich NMR strukturelle Aufklärung, wie die Verbesserung der Empfindlichkeit von DNP deutlich verkürzt sich die experimentelle Zeit auf diese komplexen Biomaterialien. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Verfahren für die Isotopen-Kennzeichnung des Pilzes A. Fumigatus und Vorbereitung Pilz und Pflanzenproben für Festkörper-NMR und DNP Charakterisierung. Ähnliche Kennzeichnung Verfahren auf andere Pilze mit veränderten Mediums anwendbar sein sollte, und die Probenaufbereitungsverfahren sollte generell für andere Kohlenhydrat-reiche Biomaterialien.

Protocol

1. Wachstum von 13C, 15N beschriftet Aspergillus Fumigatus Flüssigmedium Vorbereitung der unbeschrifteten und 13C, 15N beschriftet WachstumsmediumHinweis: Beide Hefe Extrakt Pepton Traubenzucker Medium (YPD) und der verbesserten minimale mittlere43 dienten für die Erhaltung der pilzartige Kultur. Alle Schritte nach dem Autoklavieren erfolgt in einer Laminar-Flow-Haube um Kontamination zu minimieren. Vorbereitung der unbes…

Representative Results

Das Isotop Kennzeichnung erheblich erhöht die Empfindlichkeit der NMR und macht es möglich für die Messung eine Reihe von 2D 13C -13C und 13C -15N Korrelation Spektren, die Zusammensetzung, die Hydratation, die Mobilität zu analysieren und Verpackung von Polymere, die integriert werden, um ein dreidimensionales Modell der Zellwand Architektur (Abbildung 1) zu konstruieren. Gelingt es die einheitliche Kennzeichnu…

Discussion

Im Vergleich mit den biochemischen Methoden, hat Festkörper-NMR Vorteile als eine nicht-destruktive und hochauflösende Technik. NMR ist auch im kompositorischen Analyse quantitativer und im Gegensatz zu den meisten anderen Analysemethoden, tut nicht haben die Unsicherheiten eingeführt durch die begrenzte Löslichkeit von Biopolymeren. Errichtung des derzeitigen Protokolls ermöglicht zukünftige Studien auf kohlenhydratreiche Biomaterialien und funktionalisierten Polymere. Allerdings sollte angemerkt werden, dass die …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation durch NSF OIA-1833040 unterstützt. Die nationale hohe magnetische Feld Labor (NHMFL) wird vom Nationalfonds durch DMR-1157490 und der Zustand von Florida unterstützt. Das MAS-DNP-System bei NHMFL wird teilweise von NIH S10 OD018519 und NSF-CHE-1229170 finanziert.

Materials

Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia
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Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).
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