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Biochemistry

Préparation de champignons et de matières végétales pour l’élucidation de la structure dynamique de polarisation nucléaire RMN à l’état solide

Published: February 12, 2019
doi:
10.3791/59152
, , , , ,
1Department of Chemistry,Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology,Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

Un protocole pour la préparation de 13C,15échantillons fongiques et plantes marquées N pour la spectroscopie RMN à l’état solide multidimensionnelle et enquêtes de polarisation nucléaire dynamique (DNP) est présenté.

Abstract

Ce protocole montre comment uniformément 13C, 15N-étiqueté fongiques matériaux peuvent être produites et comment ces matériaux souples devrait être traitée pour la RMN à l’état solide et DNP sensibilité améliorée des expériences. La procédure de traitement des échantillons de la biomasse végétale est aussi détaillée. Cette méthode permet la mesure d’une série de 1D et 2D 13C –13C /15N des spectres de corrélations, qui permet l’élucidation de la structure à haute résolution des biomatériaux complexes dans leur état natif, avec une perturbation minimale. Le marquage isotopique peut être examiné en quantifiant l’intensité dans les spectres de 1D et l’efficacité de transfert de polarisation dans les spectres de corrélation 2D. Le succès de la préparation d’échantillons de polarisation nucléaire dynamique (DNP) peut être évalué par le facteur de mise en valeur de sensibilité. D’autres expériences examinant les aspects structurels des polysaccharides et protéines conduira à un modèle de l’architecture en trois dimensions. Ces méthodes peuvent être modifiés et adaptés afin d’étudier un large éventail de matériaux riches en glucides, y compris les parois naturelles des plantes, des champignons, des algues et des bactéries, ainsi que de synthèse ou conçu de polymères glucidiques et leur complexe avec d’autres molécules.

Introduction

Glucides jouent un rôle central dans divers processus biologiques tels que le stockage de l’énergie, renforcement structurel et reconnaissance cellulaire et adhérence. Ils sont enrichis dans la paroi cellulaire, qui est une composante fondamentale dans les plantes, les champignons, les algues et les bactéries1,2,3. La paroi cellulaire est une source centrale pour la production de biocarburants et de biomatériaux, mais aussi une cible prometteuse pour des thérapies antimicrobiennes4,5,6,7,8 , 9.

La compréhension contemporaine de ces matériaux complexes a été considérablement avancée par des décennies d’efforts qui ont été consacrées à la caractérisation à l’aide de quatre méthodes biochimiques ou génétiques importants. La première méthode majeure s’appuie sur des traitements séquentiels à l’aide de produits chimiques agressifs ou enzymes pour briser les parois cellulaires en différentes portions, qui est suivie par la composition et l’analyse de liaison de sucres dans chaque fraction de10. Cette méthode apporte un éclairage sur la répartition du domaine des polymères, mais l’interprétation peut prêter à confusion en raison des propriétés chimiques et physiques des biomolécules. Par exemple, il est difficile de déterminer si la fraction extractible à l’alcali provient d’un domaine unique de molécules moins structurées ou de molécules séparées dans l’espace avec la solubilité comparable. Deuxièmement, les parties extraites ou toute les parois cellulaires peut également être mesurées à l’aide de solution NMR pour déterminer les liaisons covalentes, aussi appelées réticulation, entre les différentes molécules11,12,13, 14,,15. De cette façon, la structure détaillée des ancres covalentes peut être sondée, mais limites peuvent exister en raison de la faible solubilité de polysaccharides, le relativement petit nombre de sites de réticulation et l’ignorance des effets non covalentes qui stabilise emballage de polysaccharide, y compris la liaison hydrogène, interaction électrostatique et force de van der Waals, enchevêtrement de polymère. Troisièmement, l’affinité de liaison a été déterminée in vitro à l’aide de polysaccharides isolées16,17,18,19, mais la purification procédures peuvent modifier considérablement la structure et les propriétés de ces biomolécules. Cette méthode échoue aussi à reproduire la déposition sophistiquée et l’assemblage des macromolécules après la biosynthèse. Enfin, le phénotype, de la morphologie cellulaire et de propriétés mécaniques des mutants génétiques dont la production atténuée certain composant de la paroi cellulaire hangar lumières sur les fonctions structurelles des polysaccharides, mais les preuves moléculaires plus est nécessaire pour combler ces observations macroscopiques avec la fonction ingénierie des protéines machineries20.

Les progrès récents dans l’élaboration et l’application de la spectroscopie RMN à l’état solide multidimensionnelle ont introduit une occasion unique pour résoudre ces casse-tête structurel. Expériences de RMN à l’état solide 2D/3D permettent une enquête à haute résolution de la composition et l’architecture de matériaux riches en hydrates de carbone à l’état natif sans perturbation majeure. Des études structurales ont été menées avec succès à la fois primaire et parois secondaires des plantes, la biomasse catalytiquement traitée, biofilm bactérien, le pigment fantômes chez les champignons et récemment par les auteurs, les parois des cellules intactes dans un champignon pathogène Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. le développement de polarisation nucléaire dynamique (DNP)32,33,34,35,36,,du3738 , 39 , 40 , 41 , 42 facilite considérablement l’élucidation de la structure NMR comme l’accroissement de la sensibilité par DNP nettement réduit le temps expérimental sur ces biomatériaux complexes. Le protocole décrit ici en détail les procédures de marquage isotopique du champignon a. fumigatus et préparation fongique et des échantillons de végétaux pour la caractérisation de DNP et RMN à l’état solide. Procédures d’étiquetage similaires devraient s’appliquer aux autres champignons avec milieu modifié, et les procédures de préparation d’échantillon devraient être généralement applicables aux autres biomatériaux riches en glucides.

Protocol

1. croissance de 13C, 15N-étiqueté Aspergillus fumigatus milieu liquide Préparation sans étiquette et 13C, milieu de croissance marquée N 15NOTE : Les moyen de levure Extract Peptone Dextrose (DPJ) et l’amélioration moyenne minime43 ont été utilisés pour l’entretien des cultures fongiques. Toutes les étapes après la stérilisation sont effectuées dans une hotte à flux laminaire pour minimiser la contamination….

Representative Results

L’isotope labeling sensiblement augmente la sensibilité de NMR et rend possible pour mesurer une série de 2D 13C -13C et spectres de corrélation15N 13C – d’analyser la composition, l’hydratation, la mobilité et de l’emballage de polymères, qui seront intégrés à construire un modèle tridimensionnel de l’architecture de la paroi cellulaire (Figure 1). Si l’étiquetage uniforme réussit, un ensembl…

Discussion

Comparé à des méthodes biochimiques, NMR à semi-conducteurs a des avantages comme une technique non destructive et haute résolution. RMN est également quantitative à l’analyse de la composition, et contrairement à la plupart des autres méthodes analytiques, ne fait pas ont les incertitudes introduites par la solubilité limitée de biopolymères. Mise en place du protocole actuel facilite les études futures sur les riches en glucides de biomatériaux et polymères fonctionnalisés. Toutefois, il est à noter …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation, par le biais de NSF OIA-1833040. Le laboratoire National de champ magnétique élevé (NHMFL) est pris en charge par la National Science Foundation, par le biais de DMR-1157490 et l’état de Floride. Le système MAS-DNP au NHMFL est financé en partie par les NIH S10 OD018519 et NSF CHE-1229170.

Materials

Ammonium Molybdate Tetrahydrate Acros Organics 12054-85-2
AMUPol Cortecnet C010P002
Analytical weighing balance Ohaus B730439218 Model PA84C
Bioclave 16 L VWR 470230-598
Biosafety Cabinet Labconco corporation 302319100
Boric acid VWR BDH9222 store at 15-30 °C
Cobalt(II) Chloride Hexahydrate Honeywell|Fluka 60820 ≥98 %
Copper(II) Sulfate Pentahydrate BDH BDH9312 ≥98 %
Corning LSE shaking incubator Thermo Fisher Scientific 7202152
D2O Sigma Aldrich 151882 99.9 atom % D
d6-DMSO Sigma Aldrich 151874 99.9 atom % D
d8-glycerol Sigma Aldrich 447498 ≥99 atom % D
Dialysis tubing 3.2 kDa Sigma Aldrich D2272 132724
Dipotassium Phosphate VWR BDH9266 ≥98 %
Glycerol Sigma Aldrich G5516 ≥99.5 %
Heraus Megafuge 16R Centrifuge Thermo Fischer Scientific 750004271 Maximum RCF 25,830 x g
HR-MAS Disposable Insert Kit Bruker B4493 Kel-F
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 14498 ≥99+ %
Magnesium Sulfate Heptahydrate VWR 10034998 store at 18-26 °C
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate Alfa Aesar 11563 ≥99 %
Monopotassium Phosphate VWR 470302-254 ≥99 %
pH Meter Mettler Toledo B706689216
Tetrasodium Ethylenediaminetetraacetate Acros Organics 13235-36-9 ≥99.5 %
Zinc Sulfate Heptahydrate Alfa Aesar 33399 ≥98 %
12C3, d8-glycerol Cambridge Isotope Laboratory CDLM-8660 12C3, 99.95%; D8, 98%
13C6-glucose Sigma Alrdrich 364606 ≥99 % (CP)
15N-sodium nitrate Sigma Aldrich 364606 ≥98 % 15N, ≥99 (cp)
3.2 mm sapphire NMR rotor Cortecnet B6939
3.2 mm Silicone plug Bruker B7089
4 mm MAS Rotor Kit Bruker H14355 Zirconia
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Kirui, A., Dickwella Widanage, M. C., Mentink-Vigier, F., Wang, P., Kang, X., Wang, T. Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. J. Vis. Exp. (144), e59152, doi:10.3791/59152 (2019).
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