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Environment

Identifizierung von pro- und Polyfluorinated chemische Spezies mit einem kombinierten gezielte und nicht gezielte Screening hochauflösende Massenspektrometrie-Workflow

Published: April 18, 2019
doi:
10.3791/59142
,
1Oak Ridge Institute for Science and Education, National Exposure Research Laboratory,U.S. Environmental Protection Agency, 2National Exposure Research Laboratory,U.S. Environmental Protection Agency

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die sequentielle gezielte Quantifizierung und ungezielte Analyse von fluorierten Verbindungen im Wasser durch Massenspektrometrie. Diese Methode liefert quantitative Konzentrationen bekannt Fluorochemical Verbindungen und identifiziert unbekannte Chemikalien im zugehörigen Proben mit semi-quantitative Schätzungen von ihrer Fülle.

Abstract

Historische und neue pro- und Polyfluoroalkyl Stoffe (PFASs) haben großes Interesse von der Öffentlichkeit und Behörden von der lokalen auf Bundesebene sammelte. Die Weiterentwicklung der Waldschutzgebiete Chemikalien stellt eine Herausforderung für die Umweltüberwachung, wo hinkt Weiterentwicklung gezielt Methoden unbedingt die Entdeckung neuer chemischer Verbindungen. Deshalb ein Bedürfnis, zukunftsweisende Methoden, die neue und unerwartete Verbindungen zu erkennen, überwachen diese Spezies im Laufe der Zeit und lösen Details ihrer chemischen Struktur ermöglicht zukünftige arbeiten in der menschlichen Gesundheit haben. Zu diesem Zweck ungezielte Analyse durch hochauflösende Massenspektrometrie bietet einen breiten Basis Erkennung Ansatz, der mit fast jeder Probe Vorbereitung Schema kombinierbar und bietet wichtige Funktionen für zusammengesetzte Identifikation nach ihrer Entdeckung. Hierin, wir beschreiben ein Festphasen-Extraktion (SPE) basierte Konzentration Beispielmethode für kürzere Kette und mehr hydrophilen Waldschutzgebiete Chemikalien, wie z. B. pro fluorierten Äther Säuren und Sulfonaten, abgestimmt und Analyse von Proben vorbereitet auf diese Weise in beschreiben gezielte und Nichtziel-Modi. Gezielte Methoden bieten überlegene Quantifizierung Referenzstandards gibt es aber an sich beschränkt auf erwarteten Verbindungen bei der Analyse. Im Gegensatz dazu kann ein ungezielte Ansatz das Vorhandensein von unerwarteten Verbindungen zu identifizieren und sind einige Angaben zur ihrer chemischen Struktur. Informationen über chemische Eigenschaften können verwendet werden, zu korrelieren Verbindungen Probe standortübergreifend und Fülle und auftreten im Laufe der Zeit zu verfolgen.

Introduction

Die Klasse der pro- und Polyfluoroalkyl Stoffe (PFASs) sind persistente organische Schadstoffe mit bedeutenden Gesundheitsproblem. Die spezifischen Verbindungen Perfluorooctanoic Säure (PFOA) und Perfluorooctanesulfonate (PFOS) haben Trinkwasser beratenden Gesundheitsniveaus vom EPA1,2 und ihre großen US-Produktion nicht mehr in den 2000er Jahren3,4 . Ein bedeutende Verständnis für die Eigenschaften der Waldschutzgebiete wurden Materialien in der Textil- und Verbraucher Produktherstellung Sphären, Hunderte, wenn nicht Tausende von alternativen Waldschutzgebiete Chemikalien entwickelt, um Produktnischen, einschließlich Ersatz für füllen die veralteten Verbindungen5,6,7,8. Gibt es eine laufende müssen die ökologischen Ebenen geraden Kette perfluorierten Carbonsäuren zu überwachen und sulfonates solche PFOS und PFOA ihre Verwandten homologen Reihe, aber aufstrebenden chemische Verbindungen fallen nicht durch etablierte Methoden wie EPA 537 Methode9 und häufig fehlende analytische Standards für traditionelle gezielte Analyse. Die Absicht dieses Protokolls ist somit zweifach. Es bietet einen Weg für die gezielte LC-MS/MS-Analyse der Fluorochemical Arten im Wasser wo analytische Standards zur Verfügung stehen und die nahtlose Integration von eine ungezielte, hochauflösende Massenspektrometrie-basierte Ansatz für die Datenanalyse details Dies ermöglicht die Erkennung von unbekannten oder unerwarteten Verbindungen in der gleichen Proben.

Festphasen-Extraktion (SPE) ist eine etablierte Methode für die Probe Bereinigung und Konzentration mit Anwendungen für viele Analyte und Probe Matrizen10,11. Für Waldschutzgebiete Analyse mehrere feste remanente Phasen einschließlich unpolar, polar funktionalisiert und Ionenaustausch Spalten werden in unterschiedlichem Ausmaß seit Unterklassen von fluorierten Arten in einer Vielzahl von Matrizen9,12 13,14,15,16. Fortschritte in der SPE Probenanalyse mit Online-Setups erheblich erhöhen den Durchsatz des Ansatzes und verbessert die Reproduzierbarkeit der Probenbehandlung, aber die grundlegende Prozess bleibt konsistent17. Einige Anstrengungen, um die offline Konzentration der SPE mit großvolumigen Injektionen entfernen auch durchgeführt worden wären, aber diese erfordern Änderungen der Chromatographie, die sie platzieren Sie außerhalb des Bereichs der lässig Analyse18,19 . Unsere Analyse von Proben verwendet eine Polymere schwach Anion Austausch (Wachs) remanent Phase um sauren Waldschutzgebiete Materialien gründlich von der traditionellen organischen Verunreinigungen zu trennen, während erhebliche Probe Konzentration Faktoren zu erreichen. Diese Wachs-Phase ist wichtig, die kurzkettigen perfluorierten Säuren wie Perfluorobutane Sulfonate (PFBS) oder perfluorierten Ether wie Hexafluoropropylene Oxid Dimer Säure (HFPO-DA), die mehr als die längere Kette ältere perfluorierten polar sind zu erfassen Art20,21. Wie in den letzten Waldschutzgebiete Chemie5es eine deutliche Verschiebung in Richtung kürzere fluorierten Ketten und Äther Aufnahme gab, ermöglicht diese Phase Auswahl eine gründlichere von neuartigen Verbindungen für MS-Analyse.

Gezielte LC-MS/MS Quantifizierung mit Standards authentifiziert und stabiler Isotope mit der Bezeichnung interne Standards bietet ein unübertroffenes Niveau an Spezifität und Sensitivität für die Quantitative Analyse. Während dieser Ansatz in vielen Situationen wünschenswert ist, ist es unpraktisch für allzu häufigen Situationen in der Analyse. Gezielte Ansätze funktionieren nur für Arten, die in der Probe erwartet werden und welche Methoden zuvor festgelegt wurden. Für neue und sich abzeichnende Verbindungen dieser Ansatz ist nicht in der Lage sogar Arten, die möglicherweise von Interesse, unabhängig von ihrer Chemie oder Konzentration, zu erkennen und mit niedriger Auflösung Massenspektrometer sind fast nicht in der Lage, genügend Informationen zu eindeutige chemische Zuweisungen von unbekannten Verbindungen. Infolgedessen entstanden Bereich der ungezielte Analyse, Ausschöpfung des Potenzials von hochauflösenden moderne Massenspektrometer analysiert Proben ohne vorausgesetzten Hypothese und rückwirkend Chemikalien nachweisbar Features in der Probe zuweisen. Dieser Ansatz wurde umfassend in den Bereichen der Biologie22,23,24 und Umweltwissenschaften25,26,27 in zahlreichen Klassen von Chemikalien eingesetzt. Perfluorierte Chemikalien sind besonders einfach, in dieser Methode aufgrund ihrer einzigartigen Masse spektralen Muster zu identifizieren, und Hunderte von Verbindungen sind nur die letzten paar Jahre5,28beschrieben worden.

Das Protokoll hier besprochenen soll richten Sie gezielte LC-MS/MS Waldschutzgebiete Quantifizierung mit der Notwendigkeit zu identifizieren und neue Verbindungen des Interesses semi-quantitativ zu überwachen. Die SPE Phase Auswahl und Probe Präparationstechniken dienen der Erfassung von mehr hydrophile aufstrebenden Waldschutzgebiete Säuren aus dem Wasser zu gewährleisten und kann weniger für längere Kette Polymeren und nichtionischen Arten geeignet. Darüber hinaus durch ungezielte Analyse gewonnenen Daten ist dicht und der hohen Dimensionalität, die erfordert den Einsatz von Datenanalyse-Software. Solche Softwarepakete sind häufig herstellerspezifisch und erfordern Änderungen zwischen Instrument Plattformen bedienen. Soweit möglich, der Analyseprozess ist in einer generischen Weise beschrieben worden und open Source/Freeware-Alternativen verwiesen, aber die Effizienz und Genauigkeit von jeder Software-Ansatz müssen im Einzelfall beurteilt werden.

Protocol

1. Sammlung von Wasserproben Vorbereitung der Waldschutzgebiete Standard Aktien Bereiten Sie eine Standardmischung Waldschutzgebiete in Methanol, enthält gezielte Verbindungen des Interesses (z. B. PFOA, PFOS, HFPO-DA) bei 1 ng/µL. Dies ist die Native Waldschutzgebiete Mischung. Kommerziell hergestellte Mischungen sind ebenfalls verfügbar (d. h. PFAC Mix A und Mix-B). Bereiten Sie eine Standardmischung mit aufeinander abgestimmten stabiler Isotope beschriftet (SIL) Waldschutzgebiete Verbindungen (z. B. 13C4- PFOA, 13C8- PFOS, 13C3- HFPO-DA) zu 1 ng/µL. Dies ist die ist Waldschutzgebiete Mischung. Kommerziell hergestellte Mischungen sind ebenfalls verfügbar (d. h. MPAFC Mix A und Mix-B).Hinweis: Wenn eine SIL-Version von der gezielten Waldschutzgebiete nicht verfügbar ist, ein Surrogat mit ähnlicher Struktur und Kette Länge kann verwendet werden (z. B. 13C2- PFHxA für HFPO-DA) Vorbereitung von Feld leer (FB), Spike leer (SB) Proben Füllen Sie zwei, Polypropylen sauber mit hoher Dichte (HDPE) oder Polypropylen (PP) Flaschen mit 1.000 mL Labor entionisiertem Wasser (DI), bekannt als Waldschutzgebiete frei.Achtung: Waldschutzgebiete Materialien haben häufig Toxizität und Karzinogenität undefiniert. Darauf sollte geachtet werden, um mündliche oder Haut zu Normen oder Stammlösungen vermeiden. Hinzufügen eines die Flaschen auf eine Endkonzentration die erwarteten Probe Konzentrationen (z. B. 100 ng/L) entspricht einer Menge von Waldschutzgebiete Standardmischung. Dies ist die Spike leer (SB). 5 mL 35 % Salpetersäure Konservierungsmittel auf Spike leer hinzugeben. Durchführen Sie SB-Probe und unspiked Feld leer zu den Probenahmeort als Kontrollen. Feld der ProbenahmeHinweis: Probensammler Nitril-Handschuhe und Probe aus fließenden Systemen wo möglich tragen. Tippen Sie auf Proben dürfen zu fließen und equilibrate vor der Probenahme (2-3 min). Sammeln Sie 500-1.000 mL Wasser von der Feld-Position in eine saubere Flasche HDPE oder PP. Probenflaschen und Feld leer 5 mL 35 % Salpetersäure Konservierungsmittel hinzufügen.Achtung: Salpetersäure ist ätzend und ein starkes Oxidationsmittel 2. Beispiel Extraktion Hinweis: Waldschutzgebiete sind allgegenwärtig und anhaltend. Sicherzustellen Sie, dass alle Lösungsmittel des höchsten Grades und auf niedriger Ebene Waldschutzgebiete Kontamination analysiert wurden. Spülen Sie alle Laborgeräte für die Zubereitung von Normen vor der Herstellung von Rohlingen und Proben. Vorbehandlung der Probe Gießen Sie jede Probe in einem separaten, vorgereinigten 1 L HDPE graduierte Zylinder und Datensatz das genaue Volumen. Die entleerten Probenflasche 10 mL Methanol hinzu, cap sie, und gut schütteln, um adsorbierten Waldschutzgebiete aus dem Inneren der Flasche spülen. Die ausgespülte Flasche mit Methanollösung spülen die gemessenen Wasserprobe zurückzukehren. Standardkurve für Quantifizierung Geben Sie acht, 1 L HDPE/PP-Flaschen mit Waldschutzgebiete-freie VE-Wasser. Wählen Sie aus acht gleichmäßig verteilte Konzentrationen der gewünschten Quantifizierung abdeckt. Zum Beispiel: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750 und 1000 ng/L für eine Reihe von 10-1.000 ng/L. Jede Flasche die Endkonzentrationen Waldschutzgebiete in 2.2.2 bringen eine Menge von einheimischen Waldschutzgebiete Mischung hinzufügen (z. B. 100 µL Waldschutzgebiete Mix A bis 1L DI Wasser = 100 ng/L). Internen standard hinausHinweis: Zugabe von stabilen Isotop mit der Bezeichnung internen Standards (IS) ist nur erforderlich, wenn neben ungezielte Analyse quantitativer Ergebnisse gewünscht werden. Jede Probe in einer Konzentration, die Annäherung an des Mittelpunkt der die Kalibrierkurve ist Waldschutzgebiete Mischung hinzufügen (z. B. 250 µL ist Waldschutzgebiete Mix = 250 ng/L) Filtration Filtern Sie Proben durch GF/A Glasfaser Filter (47 mm, 1,6 µm Porengröße) unter sanfte Vakuum in einem vorgereinigten HDPE Isolierflasche 1 L. Wenn Feinstaub in der Flasche bleibt, mit zusätzlichen deionisiertes Wasser in den Filter zu spülen. Das gefilterte Wasser an die Probenflasche oder einen neuen Container für Festphasenextraktion zurückgeben. Festphasenextraktion (SPE)Hinweis: Patrone Konzentration beschrieben verwendet hier eine konstanten Fluss Kolbenpumpe. Alternative Methoden der Konzentration über ein Vakuum vielfältigen20 oder über ein Online-SPE-LC-MS17 Setup sind möglich aber nicht diskutiert. Eine schwache Anion Austausch (Wachs) Patrone mit 25 mL Methanol Zustand. Zustand der Wachs-Kartusche mit einer zusätzlichen 25 mL entionisiertem Wasser. Position-Pumpe Schlauch in gefilterten Musterflaschen zeichnen und beschriften SPE Kartuschen mit entsprechenden Beispielnamen. Pumpe 500 mL Probenwasser durch die Patrone mit einer stetigen Fluss-Rate von 10 mL/min (500 mL gesamt), verwerfen durchströmten Flüssigkeit zu verlieren.Hinweis: Größere oder kleinere Mengen können je nach der erwarteten Probe Konzentrationen konzentriert werden. Entfernen Sie die Patrone aus Kolbenpumpe für Elution.Hinweis: Wenn zusätzliche Proben unter Verwendung der gleichen Pumpe zu konzentrieren, sollte die Kolbenpumpe mit 25 mL Methanol gespült werden vor der Installation die nächsten Patrone für Gleichgewichtherstellung. SPE Patrone auf vielfältige Vakuum übertragen und mit gläsernen Behälter auszustatten. Spülen Sie die SPE Patrone mit 4 mL 25 mM, pH 4,0 Natrium Acetat Puffer unter sanfte Vakuum. Durchströmung zu verwerfen. Waschen Sie SPE Patrone mit 4 mL neutral Methanol.Anmerkung: Waschen Sie neutrale Fraktion gesammelt werden kann, wenn bestimmte nichtionische polare Analyten zu erwarten sind. Ansonsten um Abfälle entsorgen Legen Sie eine 15 mL Polypropylen Zentrifugenröhrchen unter jede SPE Patrone Laufmittel zu sammeln. Eluieren Sie Probe mit 4 mL 0,1 % Ammonium Hydroxid in Methanol. Entfernen Sie Elution Rohr zu und reduzieren Sie Eluat Volumen auf 500-1.000 µL durch Verdampfung unter trockenem Stickstoff-Stream in einem Wasserbad bei leicht erhöhter Temperatur (40 ° C). Konzentrierte Probe, die Extrakte vor der Analyse bei Raumtemperatur aufbewahrt werden können. Gezielte LC-MS/MS Quantifizierung Verdünnte 100 µL Probe mit 300 µL 2 mM Ammonium-Acetat-Puffer in einem HPLC-Probenfläschchen extrahieren. Kalibrieren und equilibrate eine HPLC und MS-Systeme gemäß Anweisungen des Herstellers.Hinweis: Hintergrund Waldschutzgebiete werden häufig durch den Einsatz von Fluorpolymer-Komponenten der meisten LC-Systeme und im Sample Vial Septen erkannt. Bestätigen Sie, dass die nachweisbaren Konzentrationen Lücken vor dem Gebrauch vernachlässigbar ist. Änderung des LC Systems Teflon Komponenten ersetzen wird vorgeschlagen, wenn möglich. Die Verwendung von einem “Hold-Up”-Trennsäule angrenzend an das Mischventil LC ist auch empfohlene29. Bereiten Sie eine analytische Arbeitsvorrat aus der Standardkurve, Proben und eine zusätzliche Replikation der Standardkurve instrumentellen Drift über den Lauf zu beurteilen. Ein Beispiel-Arbeitsvorrat ist in Tabelle 1dargestellt. Analysieren Sie die Proben mit LC und MS Methoden für die gezielte widerrufen von Interesse gegründet. Der Beispiel-LC-Gradient ist in Tabelle 2 gezeigt und MS-Methoden-Parameter sind in Tabelle 3 und Tabelle 4dargestellt. Weitere ausführliche Diskussion McCord Et Al.21entnehmen. Generieren Sie eine Standardkurve aus den Standardproben mit dem Gipfel Bereichsverhältnis von Analyten an den internen Standard im Vergleich zu der Konzentration des Analyten. Generieren Sie eine quadratische Regressionsformel mit 1 / x Gewichtung für Konzentration Vorhersage9. Quantitate gezielte Analyten in jeder Probe mit dem vorbereiteten Standardkurven und Flächenverhältnis (Standardbereich / Bereich) bei jeder Messung. Wenn die Konzentration der Kalibrierung Bereich übersteigt, Verdünnen der Originalprobe mit VE-Wasser, versetzt mit entsprechenden IS Konzentration und erneut zu extrahieren, die Konzentration in den entsprechenden Bereich zu bringen. Non-gezielte LC-MS/MS-Datenerfassung Verdünnte 100 µL Probe mit 300 µL 2 mM Ammonium-Acetat-Puffer in einem HPLC-Probenfläschchen extrahieren. Kalibrieren und equilibrate eine HPLC und hochauflösende MS gemäß Anweisungen des Herstellers. Bereiten Sie eine analytische Arbeitsvorrat wie 2.6.2. Verwenden die Gerätesoftware, Datenerhebung LC-MS mit einer breiten Scan MS1 datenabhängiges Modus, MS/MS. Beispiel LC Farbverlauf in Tabelle 5zu sammeln. Weitere Diskussion über Geräteeinstellungen finden Sie in Strynar Et Al.30 und Newton Et Al.31.Hinweis: Für verbesserte MS/MS kann datenabhängig Qualitätsanalyse mit einer bevorzugten Ion eine Teilmenge der Features, die nach der Verarbeitung der Daten in 2.8.1-2.8.8 durchgeführt werden. Non-bezogene DatenverarbeitungHinweis: Datenanalyse kann mit einer breiten Palette von Software durchgeführt werden und diese Methoden spiegeln nicht die einzige oder beste Methode für eine willkürliche Dataset. Soweit möglich, bieten Schritte eine allgemeine Beschreibung, die in alternative Software durchgeführt werden kann. Verarbeitung der Beispieldaten in diesem Manuskript verwendet wurde mit Hersteller spezifische Software (Software-1 und 2 Software) als detaillierte in Newton Et al. durchgeführt.31.Führen Sie molekulare Merkmalsextraktion der chemischen Eigenschaften unter Verwendung eines mehrere open-Source Software Pakete32,33 oder Kreditor Software zur Identifizierung Monoisotopic Masse, Retentionszeiten und integrierte Peakflächen von chemischen Funktionen. Wählen Sie im Software-1, Add/Remove Beispieldateien > Dateien hinzufügen und wählen Sie die raw-Daten aus dem nicht zweckgebundenen Experiment, dann drücken Sie “OK”. Software 1 Wählen Sie im Batch rekursiv Merkmalsextraktion > Open-Methode zum Laden einer Gegenmacht Methode oder Software-Einstellungen manuell zu bearbeiten. Profinder Einstellungen für Merkmalsextraktion finden Sie in Tabelle 6. Wählen Sie im Software-1, nach Merkmalsextraktion, Datei > Exportieren als CSV…, Datei > Exportieren als CEF…, oder Datei > Exportieren als PFA… zur Weiterverarbeitung. CEF-Dateien werden für den Rest der Beschreibung angenommen. Erstellen Sie in Software 2 (MPP) ein neues Experiment mit Typ Unbekanntes und Workflow-Typ Datenimport-Assistenten , und klicken Sie auf “OK”. In MPP- Daten-Dateien auswählen und suchen Sie die exportierten Software 1 Ergebnisse (CEF oder PFA) importieren; dann klicken Sie auf weiter bis Ausrichtung Parameteroptionen angezeigt werden. Legen Sie im MPP die Compound Alignment-Werte auf 0,0 (Ausrichtung erfolgte bereits auf die Merkmalsextraktion Software 1, Schritt 2.8.1.2) dann klicken Sie auf weiter durch die einzelnen Schritte bis Ende zur Verfügung steht. Filtern Sie basierte auf analytische Reproduzierbarkeit Identifikationen. Wo mehrere wiederholte Proben zur Verfügung stehen, sollten die in Funktionen vorliegen > 80 % der einzelnen repliziert und haben eine analytische Variationskoeffizienten (CV) von < 30 % MPP wählen Sie im Versuchsaufbau > Experiment Gruppierung und weisen jede raw-Datei eine Gruppe entsprechend ihrer Herkunft-Probe (z. B. Wiederholungen aus der gleichen Quelle sollte in der gleichen Gruppe). Mehrere Gruppen können verschachtelte Variablen (z. B. Instrumental vs. technische Wiederholungen) entsprechend erstellt werden. MPP wählen Sie im Versuchsaufbau > erstellen Interpretation wählen Sie dann den Experiment-Parameter (z.B. Gruppe) und klicken Sie auf weiter , bis es fertig gibt. Dies erstellt eine Kategorie, die zukünftige Filterung auf betreiben kann. MPP wählen Sie im Qualitätskontrolle > “Filtern nach” Frequenz. Alle Entitäten und die Interpretation der Probe Group(non-averaged) 2.8.2.2 gegründet, dann drücken Sie nächsteEntity List gesetzt. Festlegen Sie für Input-Parameter Entität Aufbewahrung bei 80 % der Stichprobe in mindestens eine Bedingung, dann klicken Sie auf weiter , bis es fertig gibt. Benennen Sie die Liste Frequenz gefiltert Features MPP wählen Sie im Qualitätskontrolle > Filter auf Probe Variabilität. Entity List auf der Frequenz gefiltert Funktionen vom 2.8.2.4 und die Auslegung zu Group(non-averaged) gesetzt, dann drücken Sie nächste. Wählen Sie das Optionsfeld für Rohdaten und Reichweite des Interesses Koeffizient von Variation < 30 %. Klicken Sie nächste > Ende und speichern Sie die Liste als CV gefiltert Features. Entfernen von Features, wo keine Proben deutlich höher haben (> 3 fache) Fülle als die leere Feld (FB) Probe. Wählen Sie MPP in Analyse > Falten Änderung. CV gefiltert Features und die Interpretation der Probe, die Gruppe dann nächster Treffer Entity List gesetzt. Wählen Sie die Option Falte ändern alle gegen einzelne Bedingung und select-Bedingung FB oder was auch immer den Namen der Gruppe für die leere verarbeiteten Probe war. Auf dem folgenden Bildschirm die Fold-Change-Cutoff auf 3.0 festgelegt und klicken Sie sich durch bis zum Ende der Anweisungen. Speichern Sie die Liste als FC gefilterte Liste. Binäre Vergleiche von Einzelproben von Interesse gegen einen entsprechenden Hintergrund Probe ausführen (z. B. vorgelagerten vs. nachgeschaltet eine Punktquelle) Falte-Änderungen für einzelne chemische Eigenschaften bestimmen. Wählen Sie MPP in Analyse > Filter auf Vulkan für alle. FC gefilterte Liste und die Interpretation zu Gruppe Entity List gesetzt. Für den Fach-Änderung Zustand paar wählen Sie zwei Proben zum Vergleich (z. B. eine gekoppelte vor- und nachgelagerten Probe) und wählen Sie test Ungepaarte Mann-Whitney. Für eine vorläufige Analyse nicht wählen Sie einen Wert für mehrere Test-Korrektur auf dem folgenden Bildschirm, klicken Sie sich durch die Ergebnisdarstellung. Wählen Sie im Fenster Ergebnisse eine Falte-Änderung Cutoff von 3.0 und einem p-Wert Cutoff auf 0,1. Dann beenden und Export der Liste als Vorrunde Ergebnisse. Generieren Sie für jedes Objekt nach der Filterung vorhergesagten chemischen ‘Formel(n) aus die genauen Masse und zusammengesetzte Massenspektrum. Wählen Sie im MPP, Interpretation der Ergebnisse > IDBrowser Identifikation und Vorrunde Ergebnisse Entity List. Wählen Sie in der IDBrowser identifizieren alle Verbindungen mit Molekulare Formel-Generator (MFG) als die Methode der Identifizierung. In den Optionen erzeugen Formel Elemente Spalte F hinzufügen und das Maximum auf 50 gesetzt, dann wählen Sie Finish. Wählen Sie im Anschluss an Formelgenerierung Speichern und wieder zurück zum MPP. In MPP Rechtsklick die gefilterte und MFG abgestimmt Entity List und wählen Sie Exportieren aus. Speichern Sie die Ergebnisse. Die Monoisotopic Masse der Arten in der reduzierten bedeutende chemische Feature-Liste für diejenigen mit Masse Mängel bezeichnend für Fluorierung zu prüfen; siehe Art und Fiehn34. Beachten Sie chemische Serie mit gemeinsamen Polyfluorination Motive (CF2 (m/Z 49.9968), CF2O (m/Z 65.9917), CH2CF2O (m/Z 80.0074), etc.) mit Hilfe eines Massendefekt Plot oder Software-Algorithmus; siehe Diskussion Abschnitt, Liu Et Al.17, Loos Et Al.35 , und Dimzon Et Al.36. Suchen Sie vorhergesagten chemischen Formeln oder neutral Massen gegen die EPA Chemie Dashboard-Datenbank und/oder anderen Datenbanken zu möglichen chemische Strukturen zurück. Öffnen Sie das EPA Comptox Chemikalien Dashboard Batch such-Tool (https://comptox.epa.gov/dashboard/dsstoxdb/batch_search) und fügen Sie die Liste der Kennungen (Formeln oder Massen) im Feld ID nach der Auswahl der Bezeichner (z. B. MS-ready Formel oder Monoisotopic Masse). Wählen Sie Chemische Daten herunterladen… und auch keine physikalische/chemische/Toxikologie Daten für mögliche Übereinstimmungen aus der Dropdown-Liste auf Wunsch. Mit chemischen Intuition und verfügbaren Referenzdaten, entfernen Sie unwahrscheinlich Spiele mögliche chemische Struktur für jede Formel basierend auf Machbarkeit durch chemische Beständigkeit, physikalische Eigenschaften wie Ionizability oder Hydrophobie, das Vorhandensein der Herstellung von Chemikalien aus nahe gelegenen Quellen, etc. In Ermangelung von Zusatzdaten kann spektrale Machbarkeit rein auf der Grundlage der Literatur Prävalenz eingestuft werden; McEachran Et Al.37anzeigen Strukturen mit verfügbaren Standards und/oder gezielte hochauflösende MS/MS bestätigen passende Fragmente gegen Spektren von Datenbanken, in Silico theoretischen Spektren oder manuelle Kuration.

Representative Results

Quantitative LC-MS/MS-Ergebnisse werden in Form von Ionen-Chromatogramme für das gesamte Ion Chromatogramm (TIC) und die extrahierten Ion Chromatogramme (EIC) von bestimmten chemischen Übergänge für gemessenen Chemikalien (Abbildung 1). Die integrierten Peakfläche eines chemischen Übergangs bezieht sich auf die zusammengesetzten Fülle und kann verwendet werden, um die genaue Konzentration mit Hilfe einer Eichkurve normiert auf einem internen Standard (Abbildung 2) zu berechnen. Niedrig oder flache Reaktion der einzelnen Analyten weist darauf hin, dass die Kalibrierung außerhalb des linearen Bereichs des Massenspektrometers ist oder das Instrument tuning/Kalibrierung erfordert. Schlechte Präzision von Wiederholungen zeigt ein Problem mit Probeninjektion oder inkonsistente Chromatographie, die Änderung der LC Parameter erfordert. Non-bezogene Analyse über einen vollständigen Scan MS1 ergibt eine TIC für Proben (Abbildung 3), wodurch für ad-hoc-Generation von EIC für einzelne Ionen (Abbildung 4). Beliebigen Zeitpunkt chromatographische enthält Signale für chemische Spezies, und bei Verwendung einer hochauflösenden Massenspektrometer der isotopischen Fingerabdruck der Verbindung. Identifizierung von Verbindungen aus der MS1-Scan erfolgt programmgesteuert durch einen Peak-Kommissionierung-Algorithmus unter Verwendung eines mehrere Ansätze38,39,40. Peak Picking ergibt chemische Eigenschaften mit einer gemessenen genaue Masse und chromatographische Retentionszeit sowie das Massenspektrum der Ionen und die chromatographische Peakfläche. Diese Informationen werden in der Regel in einer digitalen Datenbank-Format zur Weiterverarbeitung und Filterung gespeichert, aber die verschachtelte und miteinander verbundenen Natur der Daten vom Konzept her verstanden werden kann (Abbildung 5). Die Feature-Liste ist für Verbindungen, die Erfüllung eines von mehreren Kriterien für weitere Untersuchungen ausgewählt werden gefiltert. Die erste und einfachste ist durch Massendefekt (die Differenz zwischen der genaue Masse eines Elements und seiner nominellen Masse) filtern. Waldschutzgebiete Verbindungen haben negative Masse Mängel (Abbildung 6) aufgrund ihrer Übergewicht der Fluoratome und Polyfluorinated Verbindungen haben positive, aber deutlich geringere Masse Mängel als homologe organischen Materialien31,34 . Eine zweite Methode, die Filterung Schritt soll homologen Reihe mit Wiederholungseinheiten üblich, Waldschutzgebiete Spezies zu identifizieren, wie z. B. CF2 und CF2O. identifizieren diese erfolgen kann mit Kendrick Masse defekt Grundstücke17,36, oder Software-Pakete wie R Energiesubventionen Paket35 (Abbildung 7). Anschluss an Filtern, Zuordnung der chemischen Identität auf die Shortlist des hoch differentiell beobachtet und/oder vorläufig pro / Polyfluorinated Arten können beginnen. Genaue Masse bietet eine relativ kleine Liste der möglichen chemischen Formeln für den Abgleich aber nicht ausreichend für die Identifizierung ohne Zusatz von spektrale Anpassung Isotop-Muster des Massenspektrum41. Von hochauflösenden MS1 Daten sind mindestens eine vermeintliche chemische Formeln der isotopischen Fingerabdruck Massenspektrum abgeglichen und erzielte (Abbildung 8). Formeln für den Abgleich ab-initio mit einem definierten Pool von Atomen erzeugt werden kann oder aus einer Kombination von Literatur bezogen werden können Verbindungen und den Inhalt von einer oder mehreren Datenbanken berichtet. Die Gastgeber uns EPA Chemie Dashboard (https://comptox.epa.gov/dashboard/) eine ständig aktualisierte Liste der Waldschutzgebiete Verbindungen durch die Agentur identifiziert, sowie Listen zusammengestellt von anderen Organisationen wie der NORMAN Network-42. Chemische Formeln weiter bestätigt werden können, und einige Strukturinformationen kann aus MS/MS Spektren (Abbildung 9) sammelte. Kandidat Strukturen sind aus großen chemischen Datenbanken wie dem EPA-Chemie-Dashboard, Pubchem, die CAS-Registrierung, etc. zur Verfügung. Vorhergesagte Spektren können erzeugt werden oder erworben, mit einer Vielzahl von Fragmentierung Programme und zugewiesen,43 oder MS/MS-Spektren können interpretiert werden manuell. Eine Beispiel-Data-Matrix ist verfügbar in den ergänzenden Informationen, enthält eine ganze Feature-Matrix von zehn Proben (5 stromaufwärts, 5 flussabwärts) flussaufwärts gesammelt und eine Punktquelle Fluorochemical nachgeschaltet. Jede Zeile repräsentiert eine chemische Funktion mit damit verbundenen Verweilzeit, neutralen Masse, Massenspektrum und rohen Fülle für jede Probe. (Zusätzliche Tabelle, Blatt 1). Ersten Filterung (Zusätzliche Tabelle, Blatt 2) für negative Massendefekt und statistische Signifikanz in einem ungepaarten t-Test zwischen vorgelagerten und nachgelagerten reduziert die Anzahl der “interessante” chemische Eigenschaften zu ~ 120. Vorhergesagte chemische Formeln wurden von Agilent IDBrowser erhalten und suchte gegen das EPA Comptox Chemikalien Dashboard, die zurückgegeben, dass möglich (Zusätzliche Tabelle, Blatt 3) entspricht. Die “Top-Hit” für jede chemische Formel basierend auf Daten Quellen37 wurde (Zusätzliche Tabelle, Blatt 4) zugeordnet. Beachten Sie, dass mehr als die Hälfte der restlichen Funktionen keinen qualitativ hochwertige Spiele. Identifizierten Funktionen mit keine Übereinstimmungen können das Ergebnis der Source-Fragmentierung/Addukt Formation, schlechte Formel Zuordnung oder die Identifizierung von PFASs in der Quelldatenbank nicht gefunden. Auslegung der rohen Spektren um Zuordnungen zu validieren sprengt den Rahmen dieser Handschrift, aber weitere Informationen finden Sie in den Werken zitierte15,30,31,44, 45. ID Probenname Probenart Std Conc Durchstechflasche LC-Methode MS-Methode 1 DB_001 leer 1: A, 1 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 2 DB_002 leer 1: A, 1 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 3 DB_003 leer 1: A, 1 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 4 DB_004 leer 1: A, 1 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 5 DB_005 leer 1: A, 1 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 6 FB leer 1, 2: A Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 7 10 std Standard 10 1, 3: A Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 8 25 std Standard 25 1, 4: A Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 9 50 std Standard 50 1: A, 5 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 10 100 std Standard 100 1: A, 6 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 11 250 std Standard 250 1: A, 7 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 12 500 std Standard 500 1: A, 8 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 13 750 std Standard 750 1:B, 1 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 14 1000 std Standard 1000 1:B, 2 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 15 DB_006 leer 1:B, 3 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 16 SB_DUP1 Analyten 1:B, 4 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 17 SB_DUP2 Analyten 1:B, 5 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 18 SW-Seite 03 Analyten 1:B, 6 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 19 SW-Seite 16 Analyten 1:B, 7 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 20 SW-Seite 30 Analyten 1:B, 8 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 21 DB_007 Analyten 1:C, 1 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 22 SW-Seite 19 Analyten 1:C, 2 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 23 SW-Seite 48 Analyten 1:C, 3 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 24 SW-Seite 49 Analyten 1:C, 4 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 25 SW-Seite 05 Analyten 1:C, 5 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 26 SW-Seite 47 leer 1:C, 6 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 27 DB_008 Analyten 1:C, 7 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 28 SW-Website 19_DUP Analyten 1:C, 8 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 29 SW-Seite 20 Analyten 1, 1 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 30 SW-Seite 21 Analyten 1, 2 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 31 SW-Seite 46 Analyten 1, 3 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 32 SW-Seite 47 Analyten 1, 4 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 33 DB_009 leer 1, 5 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 28 SW-Seite 32 Analyten 1, 6 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 29 SW-Seite 50 Analyten 1, 7 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 30 SW-Seite 25 Analyten 1, 8 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 31 SW-Website 21_DUP Analyten 1:E, 1 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 32 SW-Seite 52 Analyten 1:E, 2 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 33 DB_010 leer 1:E, 3 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 34 FB leer 1, 2: A Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 35 10 std Standard 10 1, 3: A Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 36 25 std Standard 25 1, 4: A Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 37 50 std Standard 50 1: A, 5 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 38 100 std Standard 100 1: A, 6 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 39 250 std Standard 250 1: A, 7 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 40 500 std Standard 500 1: A, 8 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 41 750 std Standard 750 1:B, 1 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 42 1000 std Standard 1000 1:B, 2 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 43 DB_011 leer 1:B, 2 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min 44 DB_012 leer 1:E, 4 Waldschutzgebiete Grad 400uL/min – 9 min laufen PFCMXA + HFPO-DA MS/MS – 9 min Tabelle 1: Beispiel Arbeitsvorrat für die gezielte Analyse und Quantifizierung der Waldschutzgebiete mit LC-MS/MS Zeit(min)0 % A(2,5 mM Ammoniumacetat in 5 % MeOH)90 % B(2,5 mM Ammoniumacetat in 95 % MeOH)10 5 15 85 5.1 0 100 7 0 100 7.1 90 10 9 90 10 Tabelle 2: Beispiel Farbverlauf für LC Trennung in gezielte Analyse Capilary Spannung (kv) 1.97 Kegel-Spannung (V) 15 Extraktor Spannung (V) 3 RF-Linse (V) 0,3 Quelle-Temp 150 Zugeführten Temp 40 Zugeführten Gas Flow (L/h) 300 Kegel-Gasstrom (L/h) 2 Tabelle 3: Ionisierung Quelle Parameter für die gezielte Analyse CMP Vorläufer Produkt Verweilzeit Kegel-Spannung (V) Aufprallenergie (eV) PFBA 212.80 168.75 0,01 15 10 13C 4-PFBA IST 216.80 171.75 0,01 15 10 PFPeA 262.85 218.75 0,01 15 9 PFBS NR. 1 298.70 79.90 0,01 40 30 PFBS NR. 2 298.70 98.80 0,01 40 28 PFHxA Nr. 1 312.70 118.70 0,01 13 21 PFHxA Nr. 2 312.70 268.70 0,01 13 10 13C 2-PFHxA ist 314.75 269.75 0,01 13 9 HFPO-DA 1° 329.16 168.90 0,01 10 12 HFPO-DA 2° 329.16 284.90 0,01 10 6 HFPO-DA IST 1 ° C 332.16 168.90 0,01 10 12 HFPO-DA IST 2° 332.16 286.90 0,01 10 6 PFHpA Nr. 1 362.65 168.65 0,01 14 17 PFHpA Nr. 2 362.65 318.70 0,01 14 10 PFHxS Nr. 1 398.65 79.90 0,01 50 38 PFHxS Nr. 2 398.65 98.80 0,01 50 32 13C 4-PFHxS ist 402.65 83.90 0,01 50 38 PFOA ° 1 412.60 168.70 0,01 15 18 PFOA ° 2 412.60 368.65 0,01 15 11 13C 4-PFOA IST 416.75 371.70 0,01 15 11 PFNA NR. 1 462.60 218.75 0,01 15 17 PFNA NR. 2 462.60 418.60 0,01 15 11 PFNA IST 467.60 422.60 0,01 15 11 PFOS ° 1 498.65 79.90 0,01 60 48 PFOS ° 2 498.65 98.80 0,01 60 38 13C 4-PFOS IST 502.60 79.70 0,01 60 48 PFDA NR. 1 512.60 218.75 0,01 16 18 PFDA NR. 2 512.60 468.55 0,01 16 12 13 2 – IST PFDA 514.60 469.55 0,01 16 12 Tabelle 4: Übergang Beispieltabelle und MS/MS-Parameter für den Inhalt der PFAC-MXA, zusammen mit HFPO-DA Zeit(min) % A(2,5 mM Ammoniumacetat in 5 % MeOH) % B(2,5 mM Ammoniumacetat in 95 % MeOH) 0 90 10 0,5 90 10 3 50 50 3.5 50 50 5.5 40 60 6 40 60 7 0 100 11 0 100 Tabelle 5: Beispiel Farbverlauf für LC Trennung in Nichtziel-Analyse Profinder Parameter Einstellwert Extraktion-Peak-Höhe-Filter 800 zählt Zulässige Ion(s) -H / + H Extraktion-Isotop Merkmalmodell Gemeinsamen organischen Molekülen Zulässige Ladungszustände 2 – Jan Zusammengesetzte Ionen der Schwellenwert Zwei oder mehr Ionen Ausrichtung RT Toleranz 0,40 min + 0,0 % Ausrichtung Masse Toleranz 20,00 ppm + 2.0mDa Post-Processing Absolute Höhe Filter > = 10000 zählt in einer Probe Post-Processing-MFE Score Filter > = 75 in einer Probe Peak-Integration-Algorithmus Agile 2 Peak-Integration-Höhe-Filter > = 5000 zählt Durch die Absolute Höhe Ionenfilter finden > = 7500 zählt in einer Probe Finden von Score Ionenfilter > = 50.00 in einer Probe Tabelle 6: Molekulare Extraktion und Ausrichtung Funktionseinstellungen für Profinder Software. Alle nicht aufgeführten Werte beibehalten ihre Standardeinstellungen für die Datenverarbeitung. Ionen-Fülle Schwelle Feature-Schwellen Schwelle zu replizieren (n = 5) Laufzeit Funktionen Übergeben Sie replizieren Schwelle Pass-CV-Schwelle Funktionen zu 90 % von TIC 1 x S/N 2000 nichts 8.15 Uhr 987 505 421 91 2 x S/N 5000 nichts 5.02 707 357 313 93 3 x S/N 10000 nichts 2.3 308 249 230 93 1 x S/N 2000 100 % 3.3 603 339 297 92 2 x S/N 35000 100 % 1,58 310 248 229 93 3 x S/N 10000 100 % 1,45 202 190 182 92 Tabelle 7: Vergleich der Probe Bearbeitungszeit und chemische Funktion Identifikationen für anderes Feature Extraktion Schwellenwerte. Abbildung 1 : Total Ion Chromatogramm und extrahierten Ion Chromatogramme für eine Teilmenge von perfluorierten Äther Normen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : Repräsentative Kalibrierkurven für Verbindungen zeigen abnehmende Qualität der analytische Kurve Konstruktion. Ganz links-Panel zeigt eine hochwertige Kalibrierung; Mittleren Bereich zeigt eine Verbindung mit schlechten Präzision über Vorbereitung Duplikate, besonders bei höheren Konzentrationen; Rechten Bereich zeigt eine Kurve mit schlechte Präzision und einen niedrigen linearen dynamischen Bereich, was zu flachen Frequenzgang am oberen Ende des Bereichs Kalibrierung und kein nachweisbares Signal am unteren Ende. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : Total Ion Chromatogramme (TIC) überlagert, für Oberflächenwasser gesammelt vorgelagerten und nachgelagerten eines Produktionsstandortes Fluorochemical extrahiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 : Extrahierten Ion Chromatogramme (EIC) für alle identifizierten chemische Eigenschaften von einer Oberfläche Wasserprobe enthält mehrere Fluorochemical Klassen. Jede chemische Spur ist eine andere Farbe für Differenzierung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5 : Konzeptdiagramm Roh und prognostizierten Daten für eine chemische Eigenschaft identifiziert als Hexafluoropropylene Oxid Dimer Säure (HFPO-DA). Chemische Eigenschaften sind zusammengestellt aus Software-Extraktion von raw-Daten aus MS-Messungen und chromatographische enthalten (z. B. Retentionszeit (RT)) und mass Spectrometry Informationen. Vorhergesagten Formel, Strukturen und chemische Identitäten entstehen aus rohen Messdaten für jede Funktion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 6 : Massendefekt Plot für chemische Eigenschaften identifiziert in einer Fertigung Outfall (rot, links) und Referenz Oberflächenwasser (blau, rechts). Fluorierten Verbindungen fallen in der Nähe und unterhalb der gestrichelten Null-Linie. Beachten Sie die anhaltende PFOA/PFOS-Serie im Hintergrund Oberflächenwasser Beispiel (rechts). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 7 : Masse Vs Massendefekt Plot für unbekannte chemische Eigenschaften von einer Probe Oberflächenwasser mit homologen Reihe gekennzeichnet und beschriftet von der Energiesubventionen R Paket. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 8 : Masse Spektrum an eine unbekannte chemische Eigenschaften mit prognostizierten isotopischen Intensitäten der drei mögliche chemische Formel mit der gleichen Monoisotopic Mass Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 9 : Fragmentierung Spektrum an ein Gehege mit perfluorierten Äther kommentiert Fragment Gipfeln. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 10 : Grafische Darstellung der Filterung Schwellenwerte. Von links nach rechts, Ion Fülle Schwellenwert für chemische Funktion Massenspektren Fülle Schwellenwert für die extrahierten chromatographische Eigenschaften verfügen und Schwelle für Feature-Erkennung Frequenz in einem Experiment dreifacher Injektion zu replizieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Probenbehandlung und Vorbereitung
Die Einbeziehung der Referenz/Spike Standards sind für eine gezielte Analyse von höchster Bedeutung, da sie eine Rücklaufsperre bieten für analytische Gültigkeit überprüfen. Mangel an QC Proben verhindert, dass die Genauigkeit der Ergebnisse zu beurteilen; die allgegenwärtige Natur Fluorochemicals bedeutet, dass Chance Kontamination von Feldproben, Verarbeitung, Materialien oder LC-MS-System nicht ungewöhnlich ist und berücksichtigt werden muss. Darüber hinaus ermöglicht es für die Validierung des Protokolls unabhängig von Schwankungen in der täglichen Probe Verarbeitung, da viele Schritte sind sehr variabel, insbesondere die SPE und Konzentration Beispielschritte. Die Gewinnung von beiden älteren und neuartige perfluorierte Chemikalien kann durch die Wahl der stationären Phase für Konzentration und Komponenten der Quelle Proben, wie z. B. pH-Wert und Salzgehalt46stark beeinflusst werden. Der Einfluss der Probe Bedingungen sollte berücksichtigt werden, wenn bestimmte Klassen von Pefluorinated Chemikalien von Interesse sind. Alternative Zubereitung Stichprobenplänen für Wasser-Extrakte können verwendet werden, wenn der Laboraufbau vorliegt und die nachgeschalteten Datenanalyse ähnlich bleibt.

Gezielte Datenanalyse
Für Verbindungen mit verfügbaren Normen und aufeinander abgestimmte, stabilen Isotop beschriftet interne Standards, sind die wichtigsten Aspekte für die Datenanalyse Instrumental- und Bestimmung der Methode Nachweisgrenzen und geeignete Berichterstattung Bereiche ermittelt werden, auf eine von Labor zu Labor-Basis mit Standardmethoden wie Signal-Rausch-Verhältnis von Low-Level-Standard spikes47. In Ermangelung von aufeinander abgestimmten internen Standards können Fehler von nicht übereinstimmenden Matrixeffekte auftreten, und genaue Rückseite-Vorhersage von Spike Proben kann verwendet werden, um die Genauigkeit der Messungen zu schätzen. Wenn Normen zur Vorbereitung einer Kurve fehlt, eine quantitative Schätzung eines unbekannten kann erfolgen durch Behandlung identisch zu einem eng aufeinander abgestimmte Standard Verbindung, aber Fehler in der Kalkulation sind in der Größenordnung von 10 + Falz mit begrenzte Fähigkeit, die Unsicherheit zu quantifizieren, siehe McCord, Newton und Strynar21. In diesen Fällen Trenddaten können noch gesammelt werden, aber Konzentration Schätzungen sind von Natur aus unzuverlässig.

Ungezielte Datenanalyse
Peak Kommissionierung Einstellungen haben einen erheblichen Einfluss auf die Anzahl der chemischen Eigenschaften identifiziert, aber die Qualität der Funktionsauswahl wird ebenfalls stark beeinflusst. Die Entscheidungen der Interesse an der Spitze Kommissionierung sind 1) Intensität der einzelnen Massen in Spektren, die Ionen-Fülle Schwelle aufgenommen werden (2) die Intensität der extrahierten Chromatogramm Spitzen Funktionen, die Funktionserkennung Fülle Schwelle (3) Feature berücksichtigt werden Frequenz, die Replicate Schwelle und 4) analytische Variante, die CV-Schwelle (Abbildung 10).

Setzen unrealistisch niedrige Grenzwerte für Peak Picking Ergebnisse in einer exponentiellen Zunahme Beispielzeit aufzulösenden Zusatzfunktionen der immer geringere Fülle (Tabelle 7). Die Ion-Fülle Schwelle Filter Masse spektrale Eigenschaften wo genug von den einzelnen Isotop Häufigkeiten nicht die Schwelle überschreiten. Dies wählt idealerweise nur für Funktionen mit Qualität MS Spektren, sicherzustellen, dass sie echte chemische Eigenschaften anstatt instrumental Lärm sind, und damit für Formel Vorhersage in downstream-Processing. Ein entsprechenden Schwellenwert basiert auf instrumentelle Rauschen, im Idealfall mindestens 3 x die Rauschschwelle für MS1 scannt. Feature-Fülle-Schwelle filtert chemische Eigenschaften anhand der Intensität oder Fläche die chromatographische Features extrahiert. Dieser Schritt ermöglicht Ablehnung des niedrigen Fülle Gipfel, die in der Regel chromatographische mangelhaft, haben hohe Abweichungen, oder sind das Ergebnis einer anderen schlechten Software-Extraktion. Ein entsprechenden Schwellenwert muss pro Experiment und Matrix basiert auf einem akzeptablen Niveau der Armen Funktion Generation (z. B. Funktionen unterhalb der Schwelle Ausstellung inakzeptabel schlechten Chromatographie) ermittelt werden. Weiter kann analytische QC verwendet, um Funktionen auf chromatographische Ebene basierend auf inkonsistente Identifikation im analytischen und/oder vorbereitende Wiederholungen (Replicate Schwelle) ablehnen oder basierend auf schlechte Reproduzierbarkeit über Wiederholungen (CV-Schwelle). Geeignete Ebenen hängt die Qualität der Peak-Integrations-Software verwendet und die chemischen Einheiten untersucht. Für wasserlösliche perfluorierten Verbindungen und leicht optimierten Integration Protokolle Funktionen identifiziert werden sollten, 80 % der analytischen repliziert und CVs werden voraussichtlich weniger als 30 %, wie in Methodenabschnitt fallen.

Die Gipfel von ungezielte Analyse erkannt quantitative Schätzungen der Konzentrationen von den Materialien erkannt nicht nachgeben. Weiter, die Identität des wahren unbekannten kann schwierig sein zu bestätigen, da neuartige Substanzen Fehlen von öffentlich zugänglichen Datenbanken. Neuartige Strukturaufklärung erfordert umfangreiche Analyse mit mehreren Methoden und Know-how in der Massenspektrometrie und Chemie. Normalisierung der Peakflächen der chemischen Eigenschaften kann jedoch semi-quantitative Schätzungen der Konzentrationen von unbekannten aus bekannten Arten21bereitstellen. Wenn konsistente Probenahme und Vorbereitungsschritte beschäftigt sind, kann Zeit Trendinformationen für einzelne Arten erzeugt werden, um das Fortbestehen einer Chemikalie in die Zukunft zu überwachen, wie die Antwort für eine einzelnen Arten abgesehen von großen konsistent sein sollte Variationen in der Matrix-21.

Der Hauptvorteil dieser Methode ist die Erweiterbarkeit der Probenbehandlung, gezielte und nontargeted Analyse zu ermöglichen. Gezielte Analyse gleichwertige oder bessere quantitative Informationen bietet, fehlt es sehr breite Analyse gewünscht, beim Umgang mit neuer Materialien sowie ihre Beziehung zu Matrixwerkstoffe. Anwendung einer gezielten Methodik oder sogar einen Verdächtigen screening-Methode nur auf bekannten Materialien und begrenzte Datenbanken ist ein blinder bisher unbeobachteten Arten, auch wenn sie erhebliche gesundheitliche Auswirkungen haben können. Wie verbessert die Software und Datenbanken robuster werden, wird die Genauigkeit der unbekannten Identifikation weiter steigen, mit einem gleichzeitigen Rückgang die investierte Zeit und Fachkompetenz erforderlich, die multidimensionalen Daten generiert dadurch zu analysieren Ansatz. Trotzdem ist derzeit generierte Daten der zukünftigen Wertschöpfung, da Daten banking eine Post-hoc-Analyse mit einer neu entwickelten Software ermöglicht und Vergleich über die Zeit hinweg, ermöglicht auch wenn die Identität einer detektierten Verbindung derzeit unbekannt ist.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die US Environmental Protection Agency, durch sein Büro für Forschung und Entwicklung, finanziert und verwaltet die Forschung hier beschrieben. Dieses Dokument wurde von der US Environmental Protection Agency, Office of Research und Entwicklung überprüft und zur Veröffentlichung freigegeben. In diesem Artikel geäußerten Meinungen sind diejenigen der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien der U.S. Environmental Protection Agency. Diese Forschung wurde teilweise durch einen Termin, um die Postdoctoral Research Program am nationalen Exposition Research Laboratory von Oak Ridge Institut für Wissenschaft und Bildung durch interinstitutionelle Vereinbarung DW89992431601 zwischen verwalteten unterstützt die US Department of Energy und der US Environmental Protection Agency.

Materials

Acqity ultra-high performance liquid chromatography system  Waters Corporation Modified with PFCs analysis kit (176001744); equivalent UPLC system is acceptible if PFAS background is checked and confirmed to be low
Ammonium acetate Fluka 17836 Mass spectrometry grade >99% pure
Ammonium Hydroxide Sigma-Aldrich 338818
Balance Mettler AB204S
BEH C18 reverse phase UPLC column, 2.1×50 mm, 1.7 μm  Waters Corporation 186002350
Dual piston syringe pump  Waters Corporation SPC10-C
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich ARK2183 
Glass Microfiber Filters Whatman 1820-070
High density polyethelye sample bottle  Nalgene 2189-0032 
High Resolution Mass Spectrometer Various Mass Spectrometer should be capable of providing accurate mass to <10ppm and collecting MS/MS data.  Agilent 6530 qTOF and Thermo Fisher Orbitrap Fusion were used in this work
Methanol Sigma-Aldrich
Nitric Acid (35% w/w) Thermo Fisher Scientific SVCN-5-1 Can be prepared in house using concentrated nitric acid and reagent water
Polypropylene Buchner funnel ACE Glass 12557-09 
Polypropylene cenitrfuge tube and cap BD Falcon 352096
Polypropylene Vacuum Flask (1 L) Nalgene DS4101-1000
Quattro Premier XE triple quadrupole mass spectrometer  Waters Corporation Equivalent triple-quadrupole or better system can be used instead, should provide high sensitivity and stability for targeted analysis
Reagent Water Any source determined to be PFAS free
Sodium Acetate Sigma-Aldrich W302406
TurboVap nitrogen evaporator  Caliper Life Sciences 103198 Equivalent systems or rotary vacuum evaporator may be used instead
Weak anion exchange SPE cartridge (Oasis WAX Plus) Waters Corporation 186003519
Standard Solutions
2,3,3,3-Tetrafluoro-2-(1,1,2,2,3,3,3-heptafluoropropoxy)propanoic acid (HFPO-DA) Wellington HFPO-DA
Additional targeted compound standards of interest to be determined based on preliminary analysis and standard availability
Mass labeled HFPO-DA Wellington M2HFPO-DA
Native PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) Wellington PFAC-MXA or PFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest
Stable Isotope Labeled PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL) Wellington MPFAC-MXA or MPFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest as appropriate for Native PFASs
Software
Mass Profiler Professional Agilent Or open source software packages
Profinder Agilent Or open source software packages
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References

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McCord, J., Strynar, M. Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow. J. Vis. Exp. (146), e59142, doi:10.3791/59142 (2019).
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