Incorporación de un procedimiento de biopsia del hígado Survivable en ratones para evaluar la resolución de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH)
Summary
En ajustes clínicos, una biopsia del hígado se utiliza para evaluar estadios de esteatohepatitis no alcohólica (esteatosis, inflamación, hepatocitos en globo y fibrosis). Aquí ilustramos una biopsia del hígado survivable en ratones que se puede utilizar para análisis histológicos para permitir la evaluación de los agentes terapéuticos de forma más alineada con los ensayos clínicos.
Abstract
Ensayos clínicos que evalúan los tratamientos para el tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) implican una línea de base y final de la biopsia del hígado del estudio y evaluación de la mejora en las terminales de la enfermedad, reflejadas a menudo como un porcentaje de cada brazo de tratamiento que mejoraron, empeoró o permaneció sin cambios. Tradicionales estudios preclínicos de roedores para las supuestas terapias de NASH a menudo están limitados por no saber el nivel de hígado enfermedad/NASH presente en el inicio de la intervención terapéutica, en lugar de asignaron al azar grupos de tratamiento en los extremos fácilmente medibles como peso corporal, estado metabólico o similar. Aquí, describimos una técnica de biopsia del hígado en una inducida por la dieta NASH modelo con ratones, para la evaluación de la enfermedad hepática de base para excluir a los ratones que no presentan fibrosis y distribuir igualmente animales con fibrosis similar entre grupos de tratamiento. Estos niveles luego se pueden comparar con los niveles terminal, después de la intervención para una comprensión más verdadera de efectos farmacológicos in vivo y así más reflejan estrategias de diseño de los ensayos clínicos. El ratón es correctamente anestesiado y preparado para la cirugía con las condiciones de esterilidad. Se hace una pequeña incisión en el abdomen superior y se expone el lóbulo lateral izquierdo del hígado. Quirúrgico se extrae una cuña del hígado, y una pieza de tamaño similar de gelatina absorbible es poner en su sitio para detener cualquier sangrado. El ratón es quirúrgico suturado y engrapado cerrado y se recuperará a la normalidad dentro de 1 día. Todo el proceso tarda 5-10 min por ratón. Aquí ejemplifican la utilidad de este procedimiento mediante el aprovechamiento de la biopsia pre-estudio para evaluar el impacto de la liraglutida glucagon-como peptide-1 (GLP-1) receptor agonista en extremos de NASH en ratones.
Introduction
Esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una enfermedad progresiva del hígado y una forma más grave de la hepatopatía grasa (EHGNA), que se está convirtiendo en cada vez más frecuente debido a su asociación con obesidad y diabetes tipo 2. No hay terapias aprobadas para la EHGNA/NASH o biomarcadores aprobados fácilmente evaluar la progresión de la enfermedad. NASH se diagnostica histológicamente mediante la evaluación de la inflamación, el exceso de lípidos hepática (esteatosis), hepatocitos en globo y fibrosis1,2,3,4. En los ensayos clínicos, estos extremos son evaluados antes del estudio en una muestra de hígado recogido mediante biopsia y de una segunda biopsia del hígado después de un periodo de tratamiento. Así, se evalúa la efectividad del agente de prueba mediante el cambio en la patología del hígado en sujetos con previamente identificar/cuantificar (es decir, biopsia-probado) NASH que se asignaron al azar a grupos de tratamiento. Estos mismos extremos histologic se utilizan en modelos de roedores evaluar potencial terapéutica de NASH en estudios preclínicos, pero sólo en el tejido terminal de sacrificaron ratones y, por tanto, sin una comprensión del grado de eficacia en la línea de base y la incapacidad de para controlar diferencias en el estado de la enfermedad de base entre los grupos de tratamiento.
Aunque el 25% de adultos con HGNA se presume que NASH basado en niveles de la aminotransferasa sérica elevada, no existen métodos definitivos alternativos para confirmar a NASH que no sean evidencia histológica4. Se han desarrollado métodos no invasivos, tales como las modalidades radiológicas (ecografía, tomografía computada y resonancia magnética) para detectar esteatosis hepática, pero estos métodos no pueden diagnosticar a NASH o determinar la etapa de fibrosis. Elastografía transitoria ofrece una modalidad no invasiva prometedora para medir la rigidez hepática. Se ha demostrado ser preciso en distinguir etapas de fibrosis. Sin embargo, la precisión disminuye con mayor índice de masa corporal (IMC) y tejido adiposo. 5 esto es problemático debido a la mayoría de los pacientes de NASH siendo obesos. Más allá de la relevancia clínica de estos enfoques, ninguna de estas modalidades se utilizan en estudios preclínicos.
Para superar esto, el grupo de investigación del Dr. Jonathan Roth fueron los primeros en poner en práctica un procedimiento de biopsia del hígado en el modelo de ratón de Amylin NASH (AMLN) de NASH6,7,8. Describe la validez predictiva de la biopsia con grado de la enfermedad de NASH y correlación con enfermedad metabólica. Aquí describimos en detalle el procedimiento de biopsia del hígado en el modelo AMLN de NASH y su utilidad en un entorno terapéutico, específicamente para evaluar la eficacia de liraglutida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos en detalle el procedimiento de biopsia del hígado del ratón primero descrito por badajo et al10y son un ejemplo de su utilidad en un modelo murino de NASH, similar a los anteriores informes6,9. El procedimiento de biopsia del hígado es una valiosa herramienta para evaluar el fenotipo de NASH antes y después del tratamiento, de manera similar a la realizada en los ensayos clínicos terapéuticos. La biopsia permite la comparación directa de cada materia, es decir, que los ratones mismo pueden ser utilizados para ambos puntos del tiempo. También nos demuestran su potencial traslacional. En un ensayo clínico en sujetos de NASH biopsia-probada, liraglutida produce una tasa de respuesta del 39% (pacientes con mejoría) en NAS, mientras que en nuestro estudio se observó una tasa de respuesta del 66% para NAS mejoradas. Por otra parte, 26% de los pacientes tenía fibrosis mayor puntuación con 9% empeoramiento, frente al 14% y 36% en el brazo de placebo, respectivamente11. En nuestro estudio, se observó una tasa de 17% de mejoría con tratamiento liraglutida. Estas comparaciones destacan el poder de la biopsia hepática de base y confirman comprensión traslacional potenciales, al menos para esta clase de terapéutica.
Es fundamental para cosechar un pedazo bastante grande de tejido del hígado durante el procedimiento de biopsia para analizar adecuadamente las características histológicas, pero también no demasiado grande de un pedazo de hígado para comprometer la función del hígado. Se observó una tasa de mortalidad de cero con esta cirugía, y los animales aparecieron completamente recuperados dentro de 1 día con la reanudación de la conducta alimentaria normal. Así, el tiempo entre la biopsia y la iniciación del estudio intervención es limitado no por la recuperación de animales pero probablemente por el tiempo de procesamiento de las muestras, análisis y posterior asignación al azar.
Utilizando el procedimiento de biopsia del hígado como método de confirmación de la fibrosis antes de intervención ayudó a reducir la variabilidad en nuestro estudio, lo que nos permite excluir los ratones que no se desarrolló completamente cierto grado de fibrosis hepática como consecuencia de la dieta de inducción AMLN NASH. Además, mejora nuestra capacidad de entender mejor el impacto de posibles intervenciones de mejora de NASH, en comparación con sólo tener una muestra hepática terminal y puntuación de NASH. Hasta que nuevas técnicas no invasivas son exploradas y aceptadas ampliamente, la biopsia del hígado es la única probada para determinar a NASH.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen con gratitud la ayuda de Sally Lee y Holly Koelkebeck por experiencia en procesamiento de tejido e inmunohistoquímica. Los autores agradecen también Donna Goldsteen y el personal de recursos de animales de laboratorio (MedImmune, Gaithersburg, MD) por su ayuda con cuidado y cría de animales y procedimientos técnicos.
Materials
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| 5-0 suture | Ethicon | J834G | |
| 7mm Wound Clips | Reflex | 203-1000 | |
| Absorbable gelatin sponge (GelFoam) | Pfizer | 09-0353-01 | Compressed, Any Size |
| Alcohol Prep Pad | VWR | 75856-902 | |
| Animal Clippers | Oster | 78005010002 | Size 40 Blade |
| Artificial Tears | Henry Schein | 048272 | Tube |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser | NDC 12496-0757-5 | |
| Iodine Prep Pads | Nice Pak Products | C12400 | |
| Sterile Drapes | Stoelting | 50981 | |
| Surgical Gloves | Medline | 54720 |
References
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