ATAC-seq analisi con DNA mitocondriale bassa contaminazione da primaria umana CD4 + linfociti T

Il dosaggio per transposase-accessibile della cromatina sequenziamento (ATAC-seq) è rapidamente diventato il principale metodo per interrogare architettura della cromatina. ATAC-seq può identificare regioni di cromatina accessibile attraverso il processo di tagmentation, la frammentazione e la codifica di DNA con lo stesso enzima, per produrre le librerie con cui sequenziamento può determinare l’accessibilità cromatinica attraverso un intero genoma. Questo processo di tagmentation è mediato dalla transposase Tn5 iperattivo, che taglia solo regioni aperte della cromatina a causa di composti sterico. Come taglia, la transposase Tn5 inserisce anche schede di sequenziamento che consentono la costruzione della libreria rapida mediante PCR e sequenziamento di nuova generazione di cromatina accessibile genoma^1,2.

ATAC-seq è diventato il metodo preferito per determinare aree di accessibilità della cromatina a causa del protocollo relativamente semplice e veloce, la qualità e la gamma di informazioni che possono essere determinati dai suoi risultati e la piccola quantità di materiale necessario di partenza. Rispetto a dnasi-seq³ (che misura anche l’accessibilità della cromatina genoma), MNase-seq⁴ (che determina posizioni nucleosoma nelle regioni del genoma aperto), e la formaldeide-mediata FAIRE-seq⁵, ATAC-seq è più veloce, più economico e più riproducibili¹. È anche più sensibile, lavorando con materiale di minor come 500 nuclei, rispetto ai 50 milioni nuclei richiesti per dnasi-seq³di partenza. ATAC-seq ha anche la capacità di fornire ulteriori informazioni sull’architettura di cromatina rispetto ad altri metodi, comprese le regioni di legame del fattore di trascrizione, nucleosoma posizionamento e cromatina aperta regioni¹. Efficace, unicellulare ATAC-seq protocolli sono stati convalidati, fornendo informazioni sull’architettura della cromatina al livello unicellulare^6,7.

ATAC-seq è stato utilizzato per caratterizzare l’architettura della cromatina attraverso un ampio spettro di tipi di ricerca e cellule, tra cui piante⁸, esseri umani⁹e molti altri organismi. E ‘ stato anche critico nell’identificazione di regolazione epigenetica di malattia stati⁷. Tuttavia, il protocollo più diffuso di ATAC-seq include il grave inconveniente di letture di sequenziamento di contaminazione da DNA mitocondriale. In alcuni set di dati, questo livello di contaminazione può essere alto come il 60% di sequenziamento risultati¹. C’è uno sforzo concertato nel campo per ridurre queste letture mitocondriale contaminanti al fine di consentire l’applicazione più efficiente di ATAC-seq^7,10,11. Qui presentiamo un protocollo ATAC-seq migliorato che riduce il tasso di contaminazione di DNA mitocondriale ad appena il 3%, permettendo la riduzione del 50% circa nel sequenziamento costi¹⁰. Ciò è reso possibile da un processo semplificato di isolamento di linfociti CD4 + e l’attivazione e un buffer di lisi migliorata che è fondamentale per minimizzare la contaminazione del DNA mitocondriale.

Questo protocollo modifiedATAC-seq è stato convalidato con una vasta gamma di cellule primarie, tra cui primario del sangue periferico umano cellule mononucleari (PBMCs)¹⁰, monociti umani primari e le cellule dendritiche (inedite) del mouse. È anche stato utilizzato con successo per interrogare le linee cellulari di melanoma in uno schermo regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) cluster di non-codificazione elements¹¹. Inoltre, il pacchetto di analisi dei dati descritto in questo protocollo e forniti su GitHub fornisce ai ricercatori nuovi ed esperti con strumenti per analizzare i dati ATAC-seq. ATAC-seq è il dosaggio più efficace per eseguire il mapping all’accessibilità cromatinica attraverso un intero genoma, e modifiche al protocollo esistente che vengono introdotti qui permetterà ai ricercatori di produrre dati di alta qualità con bassa contaminazione di DNA mitocondriale, riducendo i costi di sequenziamento e migliorando la velocità di ATAC-seq.