האטא ק-seq Assay עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי של ראשי האדם CD4 + לימפוציטים מסוג T
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע וזמינותו של כרומטין transposase נגיש רצף (האטא ק-seq)-מופעל CD4 + האדם לימפוציטים. הפרוטוקול שונתה כדי למזער מזהמים קריאות דנ א מיטוכונדריאלי מ 50% ל-3% דרך המבוא של מאגר פירוק חדש.
Abstract
האטא ק-seq הפך מתודולוגיה בשימוש נרחב במחקר של אפיגנטיקה בשל גישתה מהירה ופשוטה מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול seq האטא ק משופר אשר מפחית את זיהום קריאות דנ א מיטוכונדריאלי. בעוד פרוטוקולים האטא ק-seq הקודם נאבקו עם קורא ממוצע של 50% מזהמות דנ א מיטוכונדריאלי, המאגר פירוק ממוטבת הציג פרוטוקול זה מפחית את זיהום דנ א מיטוכונדריאלי ממוצע של 3%. פרוטוקול זה seq האטא ק משופר מאפשר ירידה 50% ליד העלות רצף. נדגים כיצד ניתן להכין ספריות האטא ק-seq אלה באיכות גבוהה מופעל CD4 + לימפוציטים, מתן הוראות שלב אחר שלב של CD4 + בידוד לימפוציט של דם דרך ניתוח נתונים. פרוטוקול seq האטא ק משופר זה אומתה במגוון רחב של סוגי תאים ויהיה תועלת מיידית והטייפונים נגישות כרומטין.
Introduction
וזמינותו של כרומטין transposase נגיש רצף (האטא ק-seq) הפך במהירות השיטה המובילה עבור חקירת ארכיטקטורת כרומטין. האטא ק-seq ניתן לזהות אזורים של כרומטין נגיש באמצעות התהליך של tagmentation מזימות, תיוג של ה-DNA על ידי האנזים, כדי לייצר ספריות אשר הרצף ניתן לקבוע כרומטין נגישות מעבר הגנום כולו. תהליך זה tagmentation מתווך על ידי היפראקטיבי Tn5 transposase, אשר רק חותך אזורים פתוחים של כרומטין עקב מכשול הסטריים nucleosomic. בזמן שזה חותך, transposase Tn5 מוסיף גם מתאמים רצף המאפשרים בנייה מהירה ספריה על ידי ה-PCR ורצף הדור הבא של הגנום כולו נגיש כרומטין1,2.
האטא ק-seq הפכה השיטה המועדפת כדי לקבוע אזורים של כרומטין נגישות עקב פרוטוקול יחסית פשוטה ומהירה, איכות ומגוון של מידע יכול להיקבע מן התוצאות שלה, ואת כמות קטנה של החל החומר הנדרש. בהשוואה DNase-seq3 (אשר גם מודד את נגישות כרומטין הגנום כולו), MNase-seq4 (הקובע נוקלאוזום עמדות באזורים פתוחים גנום), בתיווך פורמלדהיד שלהם-seq5, האטא ק-seq הוא מהיר יותר, יותר זול, יותר לשחזור1. זה גם יותר רגיש, עבודה עם החל חומר של מעטים כמו גרעינים 500, לעומת 50 מיליון גרעינים הדרושות DNase-seq3. האטא ק-seq יש גם את היכולת לספק מידע נוסף אודות אדריכלות כרומטין מאשר בשיטות אחרות, כולל אזורים של איגוד פקטור שעתוק, מיצוב נוקלאוזום כרומטין פתוח אזורים1. פרוטוקולים האטא ק-seq יעיל, תא בודד יש מאומת, המספקים מידע על האדריכלות כרומטין החד-תאיים ברמה6,7.
האטא ק-seq שימש לאפיון אדריכלות כרומטין על פני קשת רחבה של סוגי תאים ומחקר, כולל צמחים8, בני9ו רבים אורגניזמים אחרים. הוא גם היה קריטי בזיהוי epigenetic רגולציה של המחלה הברית7. עם זאת, פרוטוקול האטא ק-seq הנפוצה ביותר כולל את החיסרון העיקרי של זיהום קריאות רצף של דנ א מיטוכונדריאלי. כמה ערכות נתונים, רמת זיהום יכול להיות גבוה ככל 60% של רצף תוצאות1. יש מאמץ בשדה כדי להפחית את קריאות מיטוכונדריאלי מזהמים אלה על מנת לאפשר ליישום יעיל יותר האטא ק-seq7,10,11. כאן אנו מציגים פרוטוקול seq האטא ק משופר אשר מפחית את שיעור הזיהום דנ א מיטוכונדריאלי רק 3%, המאפשר צמצום של-50% תוך רצף עולה10. זה התאפשר על ידי תהליך מיועל של לימפוציטים בידוד CD4 + ואת הפעלת מאגר פירוק משופרת שחיוני במטרה למזער את הזיהום דנ א מיטוכונדריאלי.
פרוטוקול modifiedATAC-seq זה אומתה עם מגוון רחב של ראשי תאים, כולל דם היקפיים ראשי אדם תאי תאים (PBMCs)10, ומונוציטים ראשי האדם העכבר תאים דנדריטים (לא פורסם). הוא גם שימש בהצלחה לחקור מלנומה שורות תאים במסך חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) באשכולות של רכיבים ללא קידוד11. בנוסף, חבילת ניתוח הנתונים המתוארים פרוטוקול זה וסיפק על GitHub מספק חוקרים חדשים ומנוסה עם כלים לניתוח נתונים האטא ק-seq. האטא ק-seq וזמינותו היעיל ביותר כדי למפות כרומטין נגישות מעבר הגנום כולו, שינויים בפרוטוקול הקיים אשר הציג כאן יאפשר החוקרים להפיק נתונים באיכות גבוהה עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי, צמצום עלויות רצף ושיפור תפוקת האטא ק-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול האטא ק-seq ששונה שהוצגו במאמר זה מספק תוצאות לשחזור עם זיהום דנ א מיטוכונדריאלי מינימלי. הפרוטוקול כבר להתרגל בהצלחה לאפיין כרומטין הארכיטקטורה של האדם העיקרי PBMCs10, ומונוציטים אנושי, העכבר תאים דנדריטים (לא פורסם), ו מלנומה בתרבית תאים קווים מספר11. אנו צופ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Atsede Siba לקבלת תמיכה טכנית. C.S.C. נתמך על ידי NIH גראנט 1R61DA047032.
Materials
| 1X PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
| 5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
| 96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
| Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
| MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
| NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
| NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
| Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
| Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
| Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
| Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
| Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
| T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).
- Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis. Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Rosenberg, A. B., et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 360 (6385), 176-182 (2018).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Gate, R. E., et al. Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans. Nature Genetics. , (2018).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- . FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2018)
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
