Visualização fluorescente da Mango-Tagged RNA em géis de poliacrilamida através de um método de pós-coloração

Mango é um sistema de marcação de RNA constituído por um conjunto de quatro pequenos aptâmeros de RNA fluorescente que se ligam firmemente (ligação nanomolar) a derivados simples do thiazole-Orange (to1-biotina, Figura 1a)^1,2,3 . Em cima da ligação, a fluorescência deste ligante é aumentada 1.000-a 4.000-dobre dependendo do aptamer específico. O brilho elevado do sistema da manga, que para a manga III excede aquele da proteína fluorescente verde aumentada (eGFP), combinada com a afinidade obrigatória do nanomolar dos aptamers da manga do RNA, permite que seja usado na imagem latente e na purificação do RNA complexos^2,4.

As estruturas do raio X de Mango mim⁵, II⁶, e III⁷ foram determinadas à alta resolução, e todos os três aptâmeros utilizam um quadriplex do RNA para BIND to1-biotina (Figura 1b-D). Os núcleos compactos de todos os três aptâmeros são isolados da seqüência externa do RNA através dos motivos compactos do adaptador. Mango I e II ambos utilizam um adaptador de loop GNRA-like flexível para conectar seus núcleos de Mango a um duplex RNA arbitrário (Figura 1b, C). Em contraste, Mango III usa um motivo triplex rígido para conectar seu núcleo a uma hélice de RNA arbitrária (Figura 1D, resíduos roxos), enquanto a estrutura de Mango IV não é conhecida atualmente. Porque o núcleo ligand-obrigatório de cada um destes aptâmeros é separado da seqüência externa do RNA por estes adaptadores helicoidais, parece provável que podem tudo ser incorporados simplesmente em uma variedade de RNAs. O RNA regulamentar de 6s bacteriano (Mango i), componentes do spliceossoma do fermento (manga i), e o RNA humano de 5S, o RNA U6, e um scarna de C/D (Mango II e IV) foram marcados com sucesso nesta forma^2,8, sugerindo que muitos os RNAs biológicos podem ser etiquetados usando o sistema do aptâmeros da manga do RNA.

A desnaturação e os géis nativos são comumente usados para estudar RNAs. Os géis denaturing são usados frequentemente para julgar o tamanho do RNA ou o processamento do RNA, mas tipicamente, no caso de um borrão do Norte, por exemplo, exija diversas etapas lentas e sequenciais a fim gerar uma imagem. Quando outros aptamers cromogênicos fluorogênicos do RNA, tais como o espinafre do RNA e os bróculos, forem usados com sucesso para a imagem latente do gel⁹, nenhum sistema cromogênicos fluorogênicos do aptâmeros até agora possui o brilho elevado e a afinidade do sistema da manga, fazendo lhe do interesse considerável para investigar as habilidades de imagem de gel de Mango. Neste estudo, nós perguntamos se o sistema da manga do RNA poderia simplesmente ser estendido à imagem latente do gel, porque os comprimentos de onda da excitação e da emissão de TO1-biotina (510 nanômetro e 535 nanômetro, respectivamente) são apropriados para a imagem latente no canal do eGFP comum à maioria de fluorescente Instrumentação de digitalização de gel.

O borne-gel que mancha o protocolo apresentado aqui fornece uma maneira rápida de detectar especificamente moléculas Mango-etiquetadas do RNA em géis nativos e desnaturando da electroforese do gel do poliacrilamida (página). Este método de coloração envolve géis de imersão em um tampão contendo potássio e TO1-biotina. Os aptâmeros da manga do RNA são G-quadruplex baseado e o potássio é exigido para estabilizar tais estruturas. Usando o RNA transcrito dos moldes mínimos do ADN da Mango-codificação (veja a seção do protocolo), nós podemos simplesmente detectar tão pouco quanto o fmol 62,5 do RNA em géis nativos e em 125 fmol do RNA em géis desnaturando, usando um protocolo de mancha direto. Em contraste com manchas de ácido nucleico inespecíficos comuns (ver tabela de materiais, referida SG de Hereon), podemos identificar claramente RNA com a tag Mango mesmo quando altas concentrações de RNA total não marcado estão presentes na amostra.