Visualisation fluorescente de l'ARN étiqueté mangue dans les gels de polyacrylamide par l'intermédiaire d'une méthode de coloration

La mangue est un système de marquage à ARN composé d’un ensemble de quatre petits aptamers à ARN fluorescents qui se lient étroitement (liaison nanomolaire) à de simples dérivés du thiazole-orange (TO1-Biotine, Figure 1A)^1,2^,3 . Lors de la liaison, la fluorescence de ce ligand est multipliée par 1 000 à 4 000 selon l’aptamer spécifique. La haute luminosité du système Mango, qui pour Mango III dépasse celle de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP), combinée avec l’affinité de liaison nanomolaire des aptamers de mango d’ARN, lui permet d’être employé dans l’imagerie et la purification de l’ARN complexes^2,4.

Les structures de rayons X de Mango I⁵, II⁶, et III⁷ ont été déterminées à haute résolution, et les trois aptamers utilisent un quadruplex d’ARN pour lier TO1-Biotine (Figure 1B– D). Les noyaux compacts des trois aptamères sont isolés de la séquence externe de l’ARN par des motifs d’adaptateur compacts. Mango I et II utilisent tous deux un adaptateur flexible de boucle gNRA-like pour relier leurs cœurs de mangue à un duplex arbitraire d’ARN (figure 1B,C). En revanche, Mango III utilise un motif triplex rigide pour connecter son noyau à une hélice arbitraire de l’ARN (Figure 1D, résidus violets), alors que la structure de Mango IV n’est pas actuellement connue. Comme le noyau liant ligand de chacun de ces aptamères est séparé de la séquence externe de l’ARN par ces adaptateurs hélicoïdaux, il semble probable qu’ils puissent tous être simplement incorporés dans une variété d’ARN. L’ARN régulateur bactérien 6S (Mango I), les composants de la levure spliceosome (Mango I), et l’homme 5S ARN, U6 ARN, et un C / D scaRNA (Mango II et IV) ont tous été marqués avec succès de cette façon^2,8, ce qui suggère que de nombreux les ARN biologiques peuvent être étiquetés à l’aide du système d’aptamer DE mango d’ARN.

Les gels dénaturants et indigènes sont couramment utilisés pour étudier les ARN. Les gels dénaturants sont souvent utilisés pour juger de la taille de l’ARN ou du traitement de l’ARN, mais généralement, dans le cas d’une tache nordique, par exemple, nécessitent plusieurs étapes lentes et séquentielles afin de générer une image. Alors que d’autres aptamers fluorogènes d’ARN, tels quel’épinard d’ARN et le brocoli, ont été employés avec succès pour l’imagerie de gel 9, aucun système fluorogenic d’aptamer à ce jour possède la luminosité élevée et l’affinité du système de mangue, le faisant d’un intérêt considérable d’étudier les capacités d’imagerie par gel de Mango. Dans cette étude, nous nous sommes demandé si le système de mango d’ARN pourrait être simplement étendu à l’imagerie de gel, car les longueurs d’onde d’excitation et d’émission de TO1-Biotine (510 nm et 535 nm, respectivement) sont appropriées pour l’imagerie dans le canal d’eGFP commun à la plupart fluorescent instrumentation de balayage de gel.

Le protocole de coloration post-gel présenté ici fournit un moyen rapide de détecter spécifiquement les molécules d’ARN étiquetées mango dans les gels d’électrophorèse de gel polyacrylamide (PAGE) indigènes et dénaturants. Cette méthode de coloration consiste à tremper les gels dans un tampon contenant du potassium et de la TO1-Biotine. Les aptamers de mangue d’ARN sont g-quadruplex basés et le potassium est exigé pour stabiliser de telles structures. À l’aide de l’ARN transcrit à partir de modèles d’ADN minimaux encodants par Mango (voir la section du protocole), nous pouvons simplement détecter aussi peu que 62,5 fmol d’ARN dans les gels indigènes et 125 fmol d’ARN dans les gels dénaturants, en utilisant un protocole de coloration simple. Contrairement aux taches d’acide nucléique non spécifiques courantes (voir Tableau des matériaux, référence à SG à partir de là), nous pouvons clairement identifier l’ARN marqué par mango, même lorsque des concentrations élevées d’ARN total non étiqueté sont présents dans l’échantillon.