Fluorescerende visualisatie van mango-Tagged RNA in Polyacrylamide gels via een Poststaining methode

Mango is een RNA-tagging systeem bestaande uit een set van vier kleine fluorescerende RNA aptameren die stevig binden (nanomolar binding) aan eenvoudige derivaten van de Thiazole-Orange (TOT1-biotine, Figuur 1a)^1,2,3 . Bij het binden wordt de fluorescentie van dit ligand verhoogd 1.000-naar 4.000-voudig afhankelijk van de specifieke aptamer. De hoge helderheid van het mango systeem, dat voor Mango III dat van verbeterde groene fluorescente proteïne (eGFP) overschrijdt, combineerde met de nanomolar bindende affiniteit van de mango aptameren van RNA, laat het toe om zowel in de beeldvorming als de reiniging van RNA worden gebruikt complexen^2,4.

De X-Ray structuren van mango I⁵, II⁶, en III⁷ zijn bepaald aan hoge resolutie, en alle drie APTAMEREN gebruiken een RNA quadruplex om tot1-Biotine (Figuur 1b– D) te binden. De compacte kernen van alle drie de aptameren zijn geïsoleerd van de externe RNA sequentie via compacte adapter motieven. Mango I en II maken beide gebruik van een flexibele GNRA-achtige lus adapter om hun mango kernen aan te sluiten op een willekeurige RNA duplex (Figuur 1b, C). In tegenstelling, mango III maakt gebruik van een rigide triplex motief om de kern te verbinden met een willekeurige Helix (figuur 1d, paarse residuen), terwijl de structuur van de mango IV is momenteel niet bekend. Aangezien de ligand-bindende kern van elk van deze aptameren van de externe opeenvolging van RNA door deze spiraalvormige adapters wordt gescheiden, schijnt het waarschijnlijk dat zij allen eenvoudig in een verscheidenheid van ASE kunnen worden opgenomen. De bacteriële 6s Regulatory RNA (Mango i), componenten van de gist spliceosoom (Mango i), en de menselijke 5s RNA, U6 RNA, en een C/D scaRNA (Mango II en IV) zijn allemaal met succes gecodeerd in deze mode^2,8, wat suggereert dat veel biologische ASE kan worden gelabeld met behulp van de RNA mango aptamer systeem.

Het denatureren en de inheemse gels worden algemeen gebruikt om ASE te bestuderen. Het denatureren gels worden vaak gebruikt om de grootte van RNA of de verwerking van RNA te beoordelen, maar typisch, in het geval van een noordelijke vlek, bijvoorbeeld, vereis verscheidene langzame en opeenvolgende stappen om een beeld te produceren. Terwijl andere RNA fluorogenic aptameren, zoals RNA spinazie en broccoli, zijn met succes gebruikt voor gel Imaging⁹, geen fluorogenic aptamer systeem tot op heden beschikt over de hoge helderheid en affiniteit van de mango-systeem, waardoor het van aanzienlijk belang om te onderzoeken mango gel-Imaging capaciteiten. In deze studie, vroegen we ons af of de RNA mango systeem kan eenvoudig worden uitgebreid tot gel beeldvorming, zoals de excitatie en emissie golflengten van TOT1-Biotine (510 Nm en 535 nm, respectievelijk) zijn geschikt voorbeeld vorming in de eGFP kanaal gemeenschappelijke voor de meeste fluorescerende gel-Scanning instrumentatie.

De post-gel kleuring protocol hier gepresenteerd biedt een snelle manier om specifiek te detecteren mango-gecodeerde RNA-moleculen in native en denaturerende Polyacrylamide gel elektroforese (pagina) gels. Deze kleuring methode omvat weken gels in een buffer met kalium en TOT1-biotine. RNA mango aptameren zijn G-quadruplex gebaseerd en kalium is nodig om dergelijke structuren te stabiliseren. Gebruikend RNA dat van minimale mango-codeert de malplaatjes van DNA wordt getranscribeerd (Zie de sectie van het Protocol), kunnen wij eenvoudig zo weinig zo weinig zoals 62,5 fmol van RNA in inheemse gels en 125 fmol van RNA in het denatureren gels ontdekken, gebruikend een ongecompliceerd Protocol van de kleuring. In tegenstelling tot gemeenschappelijke niet-specifieke Nucleic zure vlekken (Zie lijst van materialen, die naar SG van hierop wordt verwezen), kunnen wij mango-geëtiketteerde RNA duidelijk identificeren zelfs wanneer de hoge concentraties van totaal untagged RNA in de steekproef aanwezig zijn.