التصور الفلورسنت من الحمض النووي الريبي المانجو الموسومة في المواد الهلامية البولي أكريلاميد عن طريق طريقة بوستينينغ
Summary
هنا نقدم طريقة حساسة وسريعة، والتمييز بعد جل تلطيخ لصورة RNAs الموسومة مع الجيش الملكي النيبالي المانجو aptamers الأول، الثاني، الثالث، أو الرابع، وذلك باستخدام إما الأصلي أو التشويه البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (صفحة) المواد الهلامية. بعد تشغيل المواد الهلامية القياسية الصفحة، يمكن أن تكون ملطخة بسهولة RNA المانجو مع TO1-البيوتين ومن ثم تحليلها باستخدام القراء الفلورسنت المتاحة عادة.
Abstract
وتستخدم المواد الهلامية البولي أكريلاميد الأصلية والتشويهية بشكل روتيني لوصف حركية الريبونوكليوبروتين (RNP) المعقدة وقياس حجم الحمض النووي الريبي، على التوالي. كما العديد من تقنيات التصوير هلام استخدام البقع غير محددة أو تحقيقات الفلوروفور مكلفة، حساسة، والتمييز، ومنهجيات التصوير الهلام يُستحسن للغاية. إن تسلسلات الرنا مانجو الأساسية هي زخارف تسلسلية صغيرة (19-22 ن) يمكن أن تكون ببساطة وبتكلفة زهيدة ملحقة بالحمض النووي الريبي ذي الأهمية، عندما تكون مغلقة بواسطة جذع RNA تعسفي. هذه العلامات المانجو ربط مع تقارب عالية وخصوصية لالثيازول البرتقالي الفلورية صلة تسمى TO1-البيوتين، الذي يصبح آلاف المرات أكثر الفلورسنت على الربط. هنا نظهر أن المانجو الأول، الثاني والثالث، والرابع يمكن استخدامها لتصوير الحمض النووي الريبي على وجه التحديد في المواد الهلامية مع حساسية عالية. يمكن الكشف عن أقل من 62.5 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية الأصلية و 125 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية المزيلة عن طريق نقع المواد الهلامية في مخزن التصوير الذي يحتوي على البوتاسيوم و 20 نانوم TO1-البيوتين لمدة 30 دقيقة. نحن نبرهن على خصوصية نظام المانجو الموسومة من خلال تصوير RNA البكتيرية 6S المانجو الموسومة في سياق خليط معقد من مجموع الحمض النووي الريبي البكتيرية.
Introduction
المانجو هو نظام وسم الجيش الملكي النيبالي يتكون من مجموعة من أربعة aptamers RNA الفلورسنت الصغيرة التي تربط بإحكام (nanomolar ملزمة) إلى مشتقات بسيطة من الثيازول البرتقالي (TO1-البيوتين، الشكل 1A)1،2،3 . عند الربط، يتم زيادة الفلورسنت من هذا ليجاند 1000- إلى 4،000 أضعاف اعتمادا على aptamer محددة. السطوع عال من المانجو نظامة, أيّ ل مانجو [إييي] يتجاوز أنّ من يعزّز بروتين خضراء [فلورسنت] ([إجفب]), يضمّ مع ال [ننوملور] التصاق تقارب من ال [رنا] مانجو [أبتمرس], يسمح هو أن يكون استعملت على حدّ سواء في التصوير والتطهير من [رنا] مجمعات2,4.
وقد تم تحديد هياكلالأشعة السينية من المانجو الأول 5، II6،وIII7 إلى دقة عالية، وجميع aptamers الثلاثة تستخدم رباعية RNA لربط TO1-البيوتين (الشكل1B-D). يتم عزل النوى المدمجة من جميع aptamers الثلاثة من تسلسل الجيش الملكي النيبالي الخارجي عن طريق زخارف محول المدمجة. المانجو الأول والثاني على حد سواء الاستفادة من مرنة GNRA مثل حلقة محول لربط النوى المانجو إلى ثنائي الحمض النووي الريبي التعسفي (الشكل1B،C). وعلى النقيض من ذلك، يستخدم مانجو الثالث عزر ثلاثي جامد لربط جوهره بحلزونية RNA اعتباطية (الشكل1D، بقايا الأرجواني)، في حين أن بنية مانجو الرابع غير معروف حاليا. بما أنّ ال [ليغّد-لّس] لب من كلّ من هذا [أبتمرس] يكون فصلت من ال [رنا] خارجيّة تسلسل ب هذا محولات حلزونيّة, يبدو هو على الأرجح أنّ هم يستطيع كلّ كنت ببساطة أدمجت داخل تشكيل ال [رنا]. وقد تم وضع علامة على 6S البكتيرية التنظيمية RNA (مانجو الأول)، مكونات من spliceosome الخميرة (مانجو الأول)، و5S الإنسان الجيش الملكي النيبالي، U6 الجيش الملكي النيبالي، وscaRNA C / D (مانجو الثاني والرابع) كل بنجاح الموسومة في هذا الأزياء2،8، مما يشير إلى أن العديد من يمكن وضع علامات RNAs البيولوجية باستخدام نظام APTAMER المانجو RNA.
تستخدم عادة ً المواد الهلامية والطبيعية لدراسة RNAs. وغالبا ما تستخدم المواد الهلامية التحلل للحكم على حجم RNA أو معالجة الحمض النووي الريبي، ولكن عادة، في حالة وصمة عار الشمالية، على سبيل المثال، تتطلب عدة خطوات بطيئة ومتتابعة من أجل توليد صورة. في حين تم استخدام APTAMERs النابية الفلورية الأخرى، مثل السبانخ والقرنبيط RNA، بنجاح للهلام التصوير9، لا يوجد نظام aptamer الفلورية حتى الآن تمتلك سطوع عالية والتقارب من نظام المانجو، مما يجعلها ذات أهمية كبيرة للتحقيق في قدرات مانجو في التصوير بهلام. في هذه الدراسة، تساءلنا عما إذا كان نظام المانجو RNA يمكن أن تمتد ببساطة إلى التصوير هلام، كما الإثارة والأطوال الموجية الانبعاثات من TO1-البيوتين (510 نانومتر و 535 نانومتر، على التوالي) هي مناسبة للتصوير في قناة eGFP المشتركة لمعظم الفلورسنت هلام المسح الآلات.
يوفر بروتوكول تلطيخ ما بعد الجل المعروض هنا طريقة سريعة للكشف على وجه التحديد عن جزيئات الحمض النووي الريبي التي تحمل علامات المانجو في المواد الهلامية البولي أكريلاميد هلام البولي أكريلاميد الأصلي والتشويه (PAGE). هذه الطريقة تلطيخ ينطوي على نقع المواد الهلامية في العازلة التي تحتوي على البوتاسيوم وTO1-البيوتين. الحمض النووي الريبي المانجو aptamers هي G-رباعية أساس والبوتاسيوم مطلوب لتحقيق الاستقرار في هذه الهياكل. باستخدام RNA نسخت من الحد الأدنى من قوالب الحمض النووي ترميز المانجو (انظر قسم البروتوكول)، يمكننا ببساطة الكشف عن أقل من 62.5 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية الأصلية و 125 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية المزيلة، وذلك باستخدام بروتوكول تلطيخ مباشرة. على النقيض من البقع الحمضية النووية غير محددة المشتركة (انظر جدول المواد، المشار إليها SG من هنا)، يمكننا تحديد بوضوح MANGO-الموسومة الجيش الملكي النيبالي حتى عندما تركيزات عالية من مجموع RNA غير الموسومة موجودة في العينة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ميزة كبيرة من علامة المانجو الفلورسنت هو أنه يمكن استخدام علامة واحدة بطرق متعددة. سطوع عالية والتقارب من هذه aptamers جعلها مفيدة ليس فقط لفي تصور الخلية2 ولكن أيضا لRNA في المختبر أو تنقية RNP4. ولذلك، هلام التصوير يمتد براعة العلامة المانجو بطريقة مباشرة. حساسية التصو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفان رازفان كوجوكارو وأمير عبد الله زاده على مساعدتهما التقنية، ولينا دولغوشينا على تصحيح المخطوطة. وتم تمويل هذا المشروع من منحة تشغيلية قدمها المجلس الكندي للبحوث الطبيعية والبحوث الهندسية إلى منظمة بي جي يو.
Materials
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018)
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
