Bir Xenogeneic Murine modelinde Graft-versus-Host hastalığının indüksiyon ve skorlama ve dijital PCR kullanarak fare dokularında ınsan T hücrelerinin ölçümü

Allojeneik hematopoetik kök hücre nakli (HSCT), lösemi gibi hematolojik malignite hastalarında kötü prognoz ile rutin tedavi haline gelmiştir. HSCT ‘nin önemli bir komplikasyonu akut Greft-versus-Host hastalığıdır (GVHD). Bir 2012 çalışma, akut GVHD ‘nin HSCT hastalarının% 39 ‘ inde, kardeş bağışçılardan nakil alan hastaların% 59 ‘ inde, alakasız bağışçılar¹‘ den nakli alan hastalarda geliştiği bildirildi. Akut GVHD, donör türeyen T hücrelerinin alıcı organlarına saldırırken oluşur. GVHD için tek başarılı terapi, son derece toksik olan ve enfeksiyon ve tümör nüks riskini artıran, son derece immünpresif ilaçlar²ile tedavi etmektir. Böylece, son yıllarda akut GVHD hayatta kalımına yapılan iyileştirmeler rağmen³,⁴,⁵, hala uzun vadeli remisyon teşvik minimal toksisite ile geliştirilmiş GVHD tedaviler için kritik bir ihtiyaç vardır.

Aşağıdaki yöntemlerin genel amacı, xenogeneic GVHD ‘yi (xenoGVHD) teşvik etmek ve puanlar etmektir. XenoGVHD modeli klinik deneyler için önceden klinik GVHD araştırma daha doğrudan çeviri için izin murine hücreleri yerine insan hücreleri ile akut GVHD ikna etmek için bir araç olarak geliştirilmiştir⁶. Bu model, intravenöz olarak insan periferik kan mononükleer hücreleri enjekte eder (PBMC) içine NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) sublethally ışınlanmış fareler. Enjekte insan T hücreleri insan antijen sunan hücreler tarafından aktive edilir (APCs) murine antijeni sunan ve aktif T hücreleri sistemik inflamasyona neden uzak dokulara göç ve sonuçta ölüm^{6,7, 8 , 9 , 10}. hastalık patolojisi ve xenoGVHD modelinde progresyon yakından insan akut GVHD taklit. Özellikle, patojenik insan t hücreleri, insan GVHD^6,9‘ da T hücresi kodlamaktadırlar ‘a benzeyen, murine büyük histouyumluluk kompleksi (MHC) proteinlerine reaktif olmaktadır. XenoGVHD modelinin birincil avantajı fare MHC-uyuşmazlığı modeli, diğer yaygın olarak kullanılan GVHD modeli üzerinde, insan hücreleri yerine murine hücreler üzerinde tedaviler test etmek için izin verir. Bu, insan hücrelerini hedef almak için yapılan herhangi bir değişiklik olmadan doğrudan kliniğe tercüme edilebilir ürünlerin test etmek için izin verir. Son zamanlarda, bu model bir insan anti-IL-2 antikor test etmek için kullanılan¹¹, insan timik düzenleyici T hücreleri (tregs)¹² ve insan mesenkimal kök hücreleri¹³ akut GVHD için potansiyel tedaviler olarak. Daha geniş bir bağlamda, bu model, insan T hücresi etkinliğini bastırabilir herhangi bir ilaç veya hücre türü için bir in vivo bastırma tahlil olarak kullanılabilir. Örneğin, stockis ve al.¹⁴ , xenogvhd modelini, αvβ8 entegrenin engelleme efektini in vivo olarak Treg baskılayıcı aktivitesinde incelemek için kullandı . Böylece, xenoGVHD modeli bir in vivo ayarında T hücrelerini hedefleyen herhangi bir tedavinin mekanizması içine anlayış sağlayabilir.

Bu protokolde açıklanan ek bir yöntem, dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) kullanarak fare dokularındaki insan T hücrelerini nasıl algılayabilirsiniz. Bu yöntemin amacı, bu modelde test edilen immünosupresif tedavilerin etkinliğini ölçen hedef dokularda T hücrelerinin göç ve proliferasyonu ölçmek için bir araç sunması. dPCR, nükrenik asitlerin ölçülmesini belirlemek için nispeten yeni bir yöntemdir¹⁵. Kısaca, PCR reaksiyon karışımı, hedef dizinin az sayıda veya hiçbir hedef içeren bölümlere ayrılır. Hedef dizi daha sonra güçlendirilir ve DNA enterkalasyon boyalar veya floresan hedef spesifik problar kullanılarak algılanır. dpcr pozitif bölümler ve Poisson istatistikleri^15,16kesir dayalı hedef dizinin kopya sayısını nicelik. DPCR ile T hücrelerinin tespiti, Akış sitometrisi ve histolojisi de dahil olmak üzere diğer alternatif yöntemlerle karşılaştırıldığında çok daha az doku gerektirir ve dondurulmuş veya sabit doku üzerinde yapılabilir. dPCR kopya numaralarını belirlemek için standart bir eğri gerektirmez, ne de teknik çoğaltır gereklidir. Bu, geleneksel nicel PCR (qPCR)¹⁶Ile karşılaştırıldığında dpcr için gereken reaktif ve şablon DNA miktarını azaltır. PCR reaksiyonunun dPCR ‘de alt reaksiyonlarına bölünmesi, hedefleri¹⁷‘ ye yoğunlaşır. Böylece, dPCR öncelikle olmayan hedef DNA büyük miktarda nadir hedefleri tespiti için bir araçtır. Örneğin, dPCR süt bakteriyel kontaminasyonu algılamak için kullanılan¹⁸, östrojen reseptör geni nadir mutasyonlar belirlemek¹⁹, ve hastaların KANıNDA dolaşan tümör DNA algılamak²⁰. Bu protokolde dPCR, xenoGVHD ile fare dokularında insan T hücrelerini tespit etmek ve ölçmek için etkili bir araç olarak hizmet vermektedir.