Indução e pontuação da doença do enxerto versus hospedeiro em modelo murino Xenogeneico e quantificação de células T humanas em tecidos de camundongo utilizando PCR digital

A transplantação hematopoietic allogeneic da pilha de haste (HSCT) transformou-se tratamento rotineiro para os pacientes que sofrem das malignidades hematológicas tais como a leucemia com prognóstico pobre. Uma complicação significativa do TCTH é A doença aguda do enxerto contra o hospedeiro (DECH). Um estudo 2012 relatou que a DECH aguda se desenvolveu em 39% dos pacientes com TCTH recebendo transplantes de doadores irmãos e 59% dos pacientes que receberam transplantes de doadores não relacionados¹. A DECH aguda ocorre quando as células T derivadas de doadores atacam os órgãos do receptor. A única terapia bem-sucedida para a DECH é o tratamento com drogas altamente imunossupressoras², que são altamente tóxicos e aumentam o risco de infecção e recorrência tumoral. Assim, apesar das melhorias que foram feitas na sobrevivência aguda do GVHD nos últimos anos^3,4,⁵, há ainda uma necessidade crítica para terapias melhoradas do GVHD com toxicidade mínima que promovem a remissão a longo prazo.

O objetivo geral dos seguintes métodos é induzir e marcar GVHD xenogénica (xenogvhd). O modelo de xenoGVHD foi desenvolvido como uma ferramenta para induzir a DECH aguda com células humanas, em vez de células murinas, permitindo a tradução mais direta da pesquisa pré-clínica de GVHD para ensaios clínicos⁶. Este modelo envolve intravenosamente injetar células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) em camundongos Nod-scid Il-2rγnull (NSG) que são irradiados células. As células t humanas injetadas são ativadas por células apresentadoras de antígeno humano (APCs) apresentando antígeno murino e as células t ativadas migram para tecidos distantes, resultando em inflamação sistêmica e, finalmente^, morte^6,7, ⁸ . º ^{, 9} anos de ^{, 10}. patologia da doença e progressão no modelo xenoGVHD imitar de perto a GVHD aguda humana. Especificamente, as células t humanas patogênicas são reativas às proteínas do complexo de histocompatibilidade Major murino (MHC), que é semelhante à aloreatividade da célula t na GVHD humana^6,9. A principal vantagem do modelo xenoGVHD sobre o modelo de incompatibilidade de MHC do mouse, o outro modelo de GVHD amplamente utilizado, é que permite o teste de terapias em células humanas, em vez de células murinas. Isto permite o teste dos produtos que podem diretamente ser traduzidos à clínica sem nenhumas modificações porque são feitos para alvejar pilhas humanas. Recentemente, este modelo foi usado para testar um anticorpo humano de anti-Il-2¹¹, pilhas de T reguladoras Thymic humanas (tregs)¹² e pilhas de haste mesenquimais humanas¹³ como tratamentos potenciais para o GVHD agudo. Em um contexto mais largo, este modelo pode ser usado como um ensaio in vivo da supressão para todo o tipo da droga ou da pilha que possa suprimir a atividade humana da pilha de T. Por exemplo, Stockis et al.¹⁴ utilizaram o modelo de xenoGVHD para estudar o efeito do bloqueio da integrina αVβ8 na atividade supressora de TREG in vivo. Assim, o modelo de xenoGVHD pode fornecer a introspecção no mecanismo de toda a terapia que alvejam pilhas de T em um ajuste in vivo.

Um método adicional descrito neste protocolo é como detectar pilhas de T humanas em tecidos do rato usando a reacção em cadeia digital do polymerase (dPCR). O objetivo deste método é oferecer uma ferramenta para quantificar a migração e proliferação de células T em tecidos-alvo, que medem a eficácia das terapias imunossupressoras sendo testadas neste modelo. a dPCR é um método relativamente novo para quantificação de ácidos nucleicos¹⁵. Momentaneamente, a mistura da reação do PCR é dividida nas divisórias que contêm números pequenos da seqüência do alvo ou do nenhum alvo de todo. A sequência alvo é então amplificada e detectada usando corantes de intercalação de DNA ou sondas fluorescentes específicas do alvo. o dpcr quantifica o número de cópias da sequência de alvos com base na fração de partições positivas e nas estatísticas de Poisson^15,16. A detecção de células T com dPCR requer muito menos tecido em comparação com outros métodos alternativos, incluindo citometria de fluxo e histologia, podendo ser realizada em tecido congelado ou fixo. dPCR não requer uma curva padrão para determinar os números de cópia, nem são réplicas técnicas necessárias. Isto reduz a quantidade de reagente e o ADN do molde necessários para dPCR comparado ao PCR quantitativo tradicional (qPCR)¹⁶. Particionar a reação de PCR em subreações na dPCR concentra efetivamente alvos¹⁷. Assim, o dPCR é primeiramente uma ferramenta para a deteção de alvos raros em uma grande quantidade de ADN do não-alvo. Por exemplo, o dPCR está sendo usado para detectar a contaminação bacteriana no leite¹⁸, identificar mutações raras no gene¹⁹do receptor do estrogen, e detectar o ADN de circulação do tumor no sangue dos pacientes²⁰. Neste protocolo, o dPCR sere como uma ferramenta eficiente para detectar e quantificar pilhas de T humanas nos tecidos dos ratos com xenoGVHD.