Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) ist zu einer Routinebehandlung für Patienten geworden, die an hämatologischen Malignomen wie Leukämie mit schlechter Prognose leiden. Eine signifikante Komplikation von HSCT ist die akute Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GVHD). Eine Studie aus dem Jahr 2012 berichtete, dass akute syZUde GVHD bei 39 % der HSCT-Patienten, die Transplantationen von Geschwisterspendern erhielten, und 59 % der Patienten, die Transplantationen von nicht verwandten Spendern erhielten, entwickelt wurde¹. Akute GVHD tritt auf, wenn von Spendern abgeleitete T-Zellen die Organe des Empfängers angreifen. Die einzige erfolgreiche Therapie für GVHD ist die Behandlung mit hochimmunsuppressiven Medikamenten², die hochgiftig sind und das Risiko einer Infektion und Tumorwiederkehr erhöhen. So besteht trotz Verbesserungen, die in den letzten Jahren beim akuten GVHD-Überleben erzielt wurden^3,4,5, immer noch einen kritischen Bedarf an verbesserten GVHD-Therapien mit minimaler Toxizität, die eine langfristige Remission fördern.

Das übergeordnete Ziel der folgenden Methoden ist es, xenogene GVHD (XenoGVHD) zu induzieren und zu bewerten. Das XenoGVHD-Modell wurde als Werkzeug entwickelt, um akute GVHD mit menschlichen Zellen anstelle von murinen Zellen zu induzieren, was eine direktere Übersetzung der präklinischen GVHD-Forschung in klinische Studien^{ermöglicht 6}. Dieses Modell beinhaltet die intravenös injizierende menschliche periphere Mononuklezellen (PBMC) in NOD-SCID IL-2R-null (NSG)-Mäuse, die subletal bestrahlt werden. Injizierte menschliche T-Zellen werden durch menschliche Antigen-präsentierende Zellen (APCs) aktiviert, die murines Antigen darstellen, und die aktivierten T-Zellen wandern zu entfernten Geweben, was zu systemischen Entzündungen und letztlich zum Tod^{6,7, 8 , 9 , 10}. Krankheitspathologie und Progression im XenoGVHD-Modell imitieren die akute GVHD des Menschen. Insbesondere sind die pathogenen menschlichen T-Zellen reaktiv auf murinen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Proteine, die der T-Zell-Alloreaktivität in humanen GVHD^6,9ähneln. Der Hauptvorteil des XenoGVHD-Modells gegenüber dem MHC-Mismatch-Modell der Maus, dem anderen weit verbreiteten GVHD-Modell, ist, dass es das Testen von Therapien an menschlichen Zellen anstelle von murinen Zellen ermöglicht. Dies ermöglicht das Testen von Produkten, die direkt in die Klinik ohne Änderungen übersetzt werden können, weil sie auf menschliche Zellen ausgerichtet sind. Kürzlich wurde dieses Modell verwendet, um einen menschlichen Anti-IL-2-Antikörper¹¹, humane thymische regulatorische T-Zellen (Tregs)¹² und menschliche mesenchymale Stammzellen¹³ als mögliche Behandlungen für akute GVHD zu testen. In einem breiteren Kontext kann dieses Modell als In-vivo-Unterdrückungstest für jedes Medikament oder jeden Zelltyp verwendet werden, der die Aktivität menschlicher T-Zellen unterdrücken kann. Zum Beispiel, Stockis et al.¹⁴ verwendet das xenoGVHD Modell, um die Wirkung der Blockierung integrin 8 auf Treg Unterdrückungsaktivität in vivo zu untersuchen. So kann das xenoGVHD-Modell Einen Einblick in den Mechanismus jeder Therapie geben, die auf T-Zellen in einer In-vivo-Einstellung abzielt.

Eine weitere in diesem Protokoll beschriebene Methode ist die Erkennung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mithilfe der digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR). Das Ziel dieser Methode ist es, ein Werkzeug zur Quantifizierung der Migration und Proliferation von T-Zellen in Zielgeweben anzubieten, die die Wirksamkeit von immunsuppressiven Therapien messen, die in diesem Modell getestet werden. dPCR ist eine relativ neuartige Methode zur Quantifizierung von Nukleinsäuren¹⁵. Kurz gesagt, das PCR-Reaktionsgemisch ist in Partitionen unterteilt, die eine kleine Anzahl der Zielsequenz oder gar kein Ziel enthalten. Die Zielsequenz wird dann verstärkt und mit DNA-Interkalierenden Farbstoffen oder fluoreszierenden zielspezifischen Sonden nachgewiesen. dPCR quantifiziert die Anzahl der Kopien der Zielsequenz basierend auf dem Bruchteil der positiven Partitionen und Poissons Statistiken^15,16. Die Detektion von T-Zellen mit dPCR erfordert im Vergleich zu anderen alternativen Methoden, einschließlich Durchflusszytometrie und Histologie, viel weniger Gewebe und kann auf gefrorenem oder festem Gewebe durchgeführt werden. dPCR benötigt keine Standardkurve zur Ermittlung von Kopiernummern und auch keine technischen Replikationen. Dies reduziert die Menge an Reagenz und Vorlagen-DNA, die für dPCR benötigt wird, im Vergleich zu herkömmlichen quantitativen PCR (qPCR)¹⁶. Die Aufteilung der PCR-Reaktion in Subreaktionen in dPCR konzentriert effektiv die Ziele¹⁷. Somit ist dPCR in erster Linie ein Werkzeug zum Nachweis seltener Ziele in einer großen Menge an Nicht-Ziel-DNA. Zum Beispiel wird dPCR verwendet, um bakterielle Kontamination in Milch¹⁸zu erkennen, seltene Mutationen im Östrogenrezeptorgen¹⁹zu identifizieren und zirkulierende Tumor-DNA im Blut von Patienten zu erkennen²⁰. In diesem Protokoll dient dPCR als effizientes Werkzeug zur Detektion und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Geweben von Mäusen mit XenoGVHD.