Induction et notation de la maladie de graft-Versus-Host dans un modèle xénogéné de murine et quantification des cellules t humaines dans des tissus de souris utilisant PCR numérique

La greffe de cellules souches hématopoïétiques allogéniques (HSCT) est devenue un traitement de routine pour les patients souffrant de malignités hématologiques telles que la leucémie avec un pronostic médiocre. Une complication significative de HSCT est la maladie aigue de greffe-contre-hôte (GVHD). Une étude de 2012 a rapporté que le GVHD aigu s’est développé dans 39% de patients deHSCT recevant des greffes des donateurs de frère et 59% de patients recevant des greffes des donateurs non apparentés 1. Le GVHD aigu se produit quand les lymphocytes T d’origine donneuse attaquent les organes du receveur. La seule thérapie réussie pour GVHD estle traitement avec les drogues fortement immunosuppressives 2, qui sont fortement toxiques et augmentent le risque d’infection et de répétition de tumeur. Ainsi, en dépit des améliorations qui ont été apportées dans la survie aigue de GVHD ces dernières années^3,4,5, il y a toujours un besoin critique pour des thérapies améliorées de GVHD avec la toxicité minimale qui favorisent la remise à long terme.

L’objectif global des méthodes suivantes est d’induire et de marquer le GVHD xénogénique (xenoGVHD). Le modèle xenoGVHD a été développé comme un outil pour induire le GVHD aigu avec des cellules humaines plutôt que des cellules murines permettant une traduction plus directe de la recherche préclinique GVHD aux essais cliniques⁶. Ce modèle consiste à injecter par voie intraveineuse des cellules mononucléaires sanguines périphériques humaines (PBMC) dans des souris NOD-SCID IL-2Rnull (NSG) qui sont irradiées sublethalment. Les lymphocytes T humains injectés sont activés par les cellules de présentation d’antigènes humains (APC) présentant l’antigène murine et les lymphocytes T activés migrent vers les tissus éloignés ayant pour résultat l’inflammation systémique et finalement la mort^{6,7, 8 Annonces , 9} (en) ^{, 10}. Pathologie et progression de la maladie dans le modèle de xénoGVHD imitent étroitement le GVHD aigu humain. Plus précisément, les lymphocytes T humains pathogènes sont réactifs aux protéines du complexe d’histocompatibilité majeur murine (MHC), qui est similaire à l’alloréactivité des lymphocytes T dans l’homme GVHD^6,9. Le principal avantage du modèle xenoGVHD sur le modèle de souris MHC-inmatch, l’autre modèle GVHD largement utilisé, est qu’il permet de tester des thérapies sur les cellules humaines plutôt que les cellules murines. Cela permet de tester des produits qui peuvent être directement traduits à la clinique sans aucune modification, car ils sont faits pour cibler les cellules humaines. Récemment, ce modèle a été utilisé pour tester un anticorps humain anti-IL-2¹¹, les cellules T de régulation thymique humaine (Tregs)¹² et les cellules souches mésenchymales humaines¹³ comme traitements potentiels pour le GVHD aigu. Dans un contexte plus large, ce modèle peut être utilisé comme un test de suppression in vivo pour tout médicament ou type de cellule qui peut supprimer l’activité des lymphocytes T humains. Par exemple, Stockis et coll.¹⁴ ont utilisé le modèle xenoGVHD pour étudier l’effet du blocage de l’intégrine v’8 sur l’activité suppressive de Treg in vivo. Ainsi, le modèle xenoGVHD peut fournir un aperçu du mécanisme de toute thérapie ciblant les lymphocytes T dans un cadre in vivo.

Une méthode supplémentaire décrite dans ce protocole est la façon de détecter les lymphocytes T humains dans les tissus de souris à l’aide de la réaction numérique en chaîne de polymérase (dPCR). L’objectif de cette méthode est d’offrir un outil pour quantifier la migration et la prolifération des lymphocytes T dans les tissus cibles, qui mesurent l’efficacité des thérapies immunosuppressives testées dans ce modèle. dPCR est une méthode relativement nouvelle pour la quantification des acides nucléiques¹⁵. En bref, le mélange de réaction PCR est divisé en partitions qui contiennent de petits nombres de la séquence cible ou pas de cible du tout. La séquence cible est ensuite amplifiée et détectée à l’aide de colorants intercalés d’ADN ou de sondes fluorescentes spécifiques à la cible. dPCR quantifie le nombre de copies de séquence cible en fonction de la fraction des partitions positives et des statistiques de Poisson^15,16. La détection des lymphocytes T avec dPCR nécessite beaucoup moins de tissu par rapport à d’autres méthodes alternatives, y compris la cytométrie du débit et l’histologie, et peut être effectuée sur des tissus congelés ou fixes. dPCR n’a pas besoin d’une courbe standard pour déterminer les numéros de copie, et les répliques techniques ne sont pas requises. Cela réduit la quantité d’ADN réactif et modèle nécessaire pour dPCR par rapport à pcR quantitatif traditionnel (qPCR)¹⁶. La partition de la réaction pcR en sous-réactions dans dPCR concentre efficacement les cibles¹⁷. Ainsi, dPCR est principalement un outil pour la détection de cibles rares dans une grande quantité d’ADN non-cible. Par exemple, dPCR est utilisé pour détecter la contamination bactérienne dans le lait¹⁸, identifier les mutations rares dans le gène récepteur d’oestrogène¹⁹, et de détecter l’ADN tumoral circulant dans le sang des patients²⁰. Dans ce protocole, dPCR sert d’outil efficace pour détecter et quantifier les lymphocytes T humains dans les tissus des souris atteintes de xénoGVHD.