زراعة الطحالب الخضراء في فقاعة العمود Photobioreactors وفحص للدهون محايدة
Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لبناء مختبر-مقياس الفقاعة العمود photobioreactors واستخدامها للثقافة الطحالب المجهرية. كما يوفر طريقة لتحديد معدل نمو الثقافة والمحتوى الدهني محايدة.
Abstract
وهناك اهتمام كبير في دراسة الطحالب المجهرية للتطبيقات الهندسية مثل إنتاج الوقود الأحيائي، والمنتجات عالية القيمة، ومعالجة النفايات. كما يبدأ معظم الجهود البحثية الجديدة في المختبرات، هناك حاجة لطرق فعالة من حيث التكلفة لاستزراع الطحالب بطريقة استنساخه. وهنا نتواصل نهجاً فعالاً للثقافة من الطحالب المجهرية في photobioreactors في المختبرات، وقياس النمو والمحتوى الدهني محايدة أن الطحالب. كما يتم تضمين إرشادات حول كيفية إعداد النظام فوتوبيوريكتور. على الرغم من أن الكائنات الحية المثال الأنواع Chlorella و أوكسينوتشلوريلا، يمكن تكييفها مع هذا النظام لزراعة مجموعة واسعة من الطحالب المجهرية، بما في ذلك الثقافات المشارك من الطحالب مع الأنواع غير الطحالب. وتزرع الثقافات الأسهم أولاً في زجاجات لإنتاج العدوى للنظام فوتوبيوريكتور. تتركز العدوى الطحالب وتحويلها إلى photobioreactors لزراعة في الوضع الدفعي. يتم جمع عينات يوميا لقراءات الكثافة البصرية. في نهاية ثقافة دفعة، خلايا يتم حصادها بالطرد المركزي، غسلها، وتجميد المجفف للحصول على تركيز وزن جاف نهائي. تركيز الوزن الجاف النهائي يستخدم لإنشاء ارتباط بين الكثافة البصرية وتركيز الوزن الجاف. استخدمت طريقة فلك معدلة في وقت لاحق لاستخراج الدهون الإجمالية من الكتلة الأحيائية المعصوفه وهو جزيئي الاستخراج لمحتواه الدهن محايدة مقايسة ميكروسكوبية باستخدام. هذا التحليل قد صدر سابقا ولكن الخطوات البروتوكول أدرجت هنا لتسليط الضوء على الخطوات الحاسمة في الإجراء حيث تحدث الأخطاء بشكل متكرر. مفاعل حيوي النظام المذكور هنا يملأ مكانة بين زراعة قارورة بسيطة والمفاعلات الحيوية التجارية تسيطر عليها تماما. يتطابق حتى مع فقط 3-4 البيولوجية كل معاملة، ونهجنا لاستزراع الطحالب ويؤدي إلى ضيق الانحرافات المعيارية في فحوصات النمو والدهن.
Introduction
تطبيق الطحالب المجهرية في الهندسة والتكنولوجيا الأحيائية قد اجتذب اهتماما كبيرا في السنوات الأخيرة. وتجري الآن دراسة الطحالب المجهرية للاستخدام في المياه المستعملة المعالجة1،2،،من34، الوقود الحيوي الإنتاج5،6،،من78، إنتاج المغذيات وغيرها9،منتجات عالية القيمة10. الطحالب هي أيضا يجري المعدلة وراثيا بمعدلات أكبر في محاولة لتحسين لياقتهم البدنية ل11،التطبيقات الهندسية الخاصة12. ونتيجة لذلك، هناك اهتمام كبير في التجريب مع الكائنات ذات الصلة صناعيا في الإعدادات التي تسيطر عليها. والغرض من هذا الأسلوب هو للتواصل نهجاً فعالاً لثقافة الطحالب المجهرية في بيئة مختبرية تحت التحكم، وقياس النمو والمحتوى الدهني محايدة أن الطحالب. تحسين نمو معدلات ومحتوى الدهون محايدة من الطحالب المجهرية قد حددت كاثنين من الاختناقات الرئيسية نحو تسويق الوقود الحيوي الطحالب13.
استخدمت مجموعة واسعة من النهج للطحالب الثقافة لأغراض تجريبية. وبصفة عامة، يمكن تقسيم هذه النهج بين زراعة في الهواء الطلق على نطاق واسع، وزراعة حوض صغير. زراعة في الهواء الطلق في photobioreactors والبرك المفتوحة المناسبة للتجريب تهدف إلى الارتقاء بمستوى العمليات التي ثبت فعلا في المختبرات (مثلاً، لاختبار الارتقاء بسلالة الدهنية عالية جديدة من الطحالب)14. ومع ذلك، زراعة صغار داخلي مناسب عند تطوير سلالات جديدة أو محسنة الطحالب أو إجراء تجارب تهدف إلى فهم الآليات البيولوجية. وفي هذه الحالات الأخيرة، مطلوب درجة عالية من التحكم التجريبي لندف عليها بعض التغييرات الطفيفة في السلوك البيولوجي. تحقيقا لهذه الغاية، غالباً ما يطلب أكسينيك الثقافات بغية التقليل من العوامل الحيوية المعقدة المرتبطة بالكائنات الأخرى (مثل البكتريا والطحالب الأخرى) التي تنمو لا محالة في نظم في الهواء الطلق واسعة النطاق. حتى عند دراسة التفاعلات بين الطحالب وغيرها من الكائنات الحية، وقد وجدنا أن استخدام الشروط التجريبية الخاضعة للغاية مفيد عند دراسة تبادل الجزيئية بين الكائنات الحية15،،من1617.
ضمن فئة زراعة الطحالب داخلي صغير، استخدمت مجموعة من النهج. ولعل النهج الأكثر شيوعاً تنمو الطحالب في قوارير Erlenmeyer على طاولة شاكر تحت18،بنك خفيفة19. ويجري تبادل الأوكسجين وأول أكسيد الكربون2 بنشر السلبي من خلال المكونات رغوة في أعلى قارورة. وقد تحسنت بعض الباحثين هذا التشكيل عن طريق تهوية نشطة في قوارير20. نهج آخر زراعة الطحالب في زجاجات، المختلطة بواسطة شريط ضجة وتهوية نشطة. وعلى الرغم من بساطتها، وجدنا أن استخدام قوارير وزجاجات غالباً ما يؤدي إلى نتائج غير متناسقة بين replicates البيولوجية. يفترض أن هذا سبب موقف آثار-مواقف مختلفة تلقي كميات مختلفة من الضوء، والتي تؤثر أيضا على درجات الحرارة الداخلية المفاعل. التناوب اليومي من المفاعلات إلى مواقع جديدة يمكن أن تساعد ولكن ليس التخفيف من المشكلة لأن مراحل معينة من نمو الطحالب (مثلاً، أوائل أسي) هي أكثر حساسية للتأثيرات الموضعية من غيرها (مثلاً، سجل المرحلة).
على الجانب الآخر من طيف التطور التكنولوجي هي photobioreactors التجارية التي تسيطر عليها تماما. هذه الأنظمة باستمرار رصد وضبط الأوضاع في المفاعل لتحسين نمو الطحالب. لديهم الإضاءة قابلة للبرمجة والتحكم في درجة الحرارة في الوقت الحقيقي ومراقبة درجة الحموضة. لسوء الحظ، أنها غالية الثمن وتكلف عادة عدة آلاف من الدولارات في المفاعل. أهم المجلات العلمية والهندسية تتطلب النسخ المتماثل البيولوجية للنتائج، مما استلزم شراء المفاعلات الحيوية متعددة. نحن الحاضرين هنا نظام مفاعل عمود فقاعة تلك الجسور الفجوة بين بسيطة (قارورة) ومتطورة (تسيطر عليها تماما مفاعل حيوي) نهج لزراعة الطحالب على نطاق المختبر. استخدام الأعمدة فقاعة ارتفاع فقاعات الغاز لتسهيل تبادل الغازات ومزيج المفاعل. هذا النهج يوفر درجة من التحكم في الإضاءة ودرجة الحرارة ولكنه يفعل ذلك بطريقة فعالة من حيث التكلفة. وعلاوة على ذلك، فقد وجدنا هذا النظام إلى نتائج متسقة عالية بين replicates البيولوجية، تخفيض العدد المطلوب من replicates البيولوجية اللازمة من أجل الحصول على نتائج مهمة إحصائيا بالمقارنة مع النهج قارورة أو زجاجة. كما أننا استخدمنا هذا النظام بنجاح زراعة مخاليط من الطحالب والبكتيريا21. بالإضافة إلى زراعة الطحالب، أننا مخطط إجراء لقياس المحتوى الدهني محايدة في الطحالب المستزرعة. الأسلوب الأخير قد تم نشرها في أماكن أخرى من22، ولكن نقوم بتضمين الإجراء هنا لتوفير الإرشادات خطوة بخطوة عن كيفية استخدامها بنجاح.
Protocol
Representative Results
Discussion
أهم الاعتبارات عند استزراع الطحالب فهم للاحتياجات المحددة للكائن أو مجموعة الكائنات. الطحالب يمكن استخدام نظام زراعة الموصوفة هنا للثقافة مجموعة واسعة من الطحالب ولكن العوامل اللاأحيائية محددة (درجة الحرارة، ووسائل الإعلام، الأس الهيدروجيني، كثافة الضوء، المستوى2 CO، معدل تهوية) ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
قدم الدعم لهذه البحوث بوزارة الزراعة المعهد الوطني للأغذية والزراعة هاتش مشروع ALA0HIGGINS ومكاتب جامعة أوبورن قائد الشرطة العسكرية، نائب الرئيس للبحوث، وصموئيل أي Ginn كلية الهندسة. وقدم الدعم أيضا من جبهة الخلاص الوطني منح كبيت-1438211.
Materials
| Supplies for airlift photobioreactor setup | |||
| 1 L Pyrex bottles | Corning | 16157-191 | For bottle reactors, humidifiers |
| 1/2" hose clamp | Home Depot | UC953A | or equivalent |
| 1/4" female luer to barb | Nordson biomedical | Nordson FTLL360-6005 | 1/4" ID, PP |
| 1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-244 | 50' |
| 1/4" in O-rings | Grainger | 1REC5 | #010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D. |
| 1/8" Female luer to barb | Nordson biomedical | FTLL230-6005 | |
| 1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing | Thermo-Nalgene | 63013-608 | 250' |
| 1/8" male spinning luer to barb | Nordson biomedical | MLRL013-6005 | |
| 1/8" multiport barb | Nordson biomedical | 4PLL230-6005 | 1/8" multiport barb |
| 1/8" NPT to barb | Nordson biomedical | 18230-6005 | 1/8" 200 series barb |
| 1/8" panel mount luer | Nordson biomedical | Nordson MLRLB230-6005 | 1/8", PP |
| 10 gallon fish tank | Walmart | 802262 | Can hold up to 8 bioreactors depending on layout |
| 100-1000 ccm flow meter | Dwyer | RMA-13-SSV | For bottle reactors |
| 2 ft fluorescent light bank | Agrobrite | FLT24 T5 | |
| 200-2500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-14-SSV | For air regulation upstream of humidifier |
| 250 mL Pyrex bottles | Corning | 16157-136 | For gas mixing after humidifier |
| 50-500 ccm flow meter | Dwyer | RMA-12-SSV | For hybridization tube reactors |
| 5-50 ccm flow meter | Dwyer | RMA-151-SSV | For CO2 flow rate control |
| Air filters 0.2 µm | Whatman/ Fisher | 09-745-1A | Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack |
| Check valves | VWR | 89094-714 | |
| Corning lids for pyrex bottles | VWR | 89000-233 | 10 GL45 lids |
| Female luer endcap | Nordson biomedical | Nordson FTLLP-6005 | Female stable PP |
| Hybridization tubes | Corning | 32645-030 | 35×300 mm, pack of 2 |
| Light timer | Walmart | 556393626 | |
| Locknuts | Nordson biomedical | Nordson LNS-3 | 1/4", red nylon |
| Low profile magnetic stirrer | VWR | 10153-690 | Low profile magnetic stirrer |
| Male luer endcap | Nordson biomedical | Nordson LP4-6005 | Male plug PP |
| Spinning luer lock ring | Nordson biomedical | Nordson FSLLR-6005 | |
| Stir bars – long | VWR | 58949-040 | 38.1 mm, for bottle reactors |
| Stir bars – medium | VWR | 58949-034 | 25 mm, for hyridization tubes |
| Supplies and reagents for culturing algae | |||
| 0.2 µm filters | VWR | 28145-491 | 13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling |
| 1 mL syringes | Air-tite | 89215-216 | For filtering spent media from daily culture sampling |
| 1.5 mL tubes | VWR | 87003-294 | Sterile (or equivalent) |
| 10 mL Serological pipettes | Greiner Bio-One | 82050-482 | Sterile (or equivalent) |
| 100 mm plates | VWR | 25384-342 | 100×15 mm stackable petri dishes, sterile |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-276 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 2 mL Serological pipette tips | Greiner Bio-One | 82051-584 | Sterile (or equivalent) |
| 2 mL tubes | VWR | 87003-298 | Sterile (or equivalent) |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 82050-348 | Sterile (or equivalent), polypropylene |
| 96 well microplate | Greiner Bio-One | 89089-578 | Polystyrene with lid, flat bottom |
| Inocculating loops | VWR | 80094-478 | Sterile (or equivalent) |
| Liquid carbon dioxide tank and regulator | Airgas | CD-50 | |
| Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay | |||
| 2 mL bead tubes | VWR | 10158-556 | Polypropylene tube w/ lid |
| 96 well microplates | Greiner Bio-One | 82050-774 | Polypropylene, flat bottom |
| Bleach | Walmart | 550646751 | Only use regular bleach, not cleaning bleach |
| Chloroform | BDH | BDH1109-4LG | |
| Dimethyl sulfoxide | BDH | BDH1115-1LP | |
| Isopropyl alcohol | BDH | BDH1133-1LP | |
| Methanol | BDH | BDH20864.400 | |
| Nile red | VWR | TCN0659-5G | |
| Pasteur pipette tips | VWR | 14673-010 | |
| Sodium chloride | BDH | BDH9286-500G | |
| Vegetable oil | Walmart | 9276383 | Any vegetable oil should work as long as it is fresh |
| Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter) | Biospec products | 11079105z | |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | XS205DU | Capable of at least 4 decimal accuracy |
| Bead homogenizer | Omni | 19-040E | |
| Benchtop micro centrifuge | Thermo | Heraeus Fresco 21 with 24×2 | Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes |
| Dry block heater | VWR | 75838-282 | Including dry block for a microplate |
| Freeze dryer | Labconco | 7670520 | 2.5L freeze drying system |
| Large benchtop centrifuge | Thermo | Heraeus Megafuge 16R Tissue | Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Capable of reading absorbance and fluorescence |
| Vortex mixer | VWR | 10153-838 |
References
- Prandini, J. M., et al. Enhancement of nutrient removal from swine wastewater digestate coupled to biogas purification by microalgae Scenedesmus spp. Bioresource Technology. , 67-75 (2016).
- Liu, C., et al. Phycoremediation of dairy and winery wastewater using Diplosphaera sp. MM1. Journal of Applied Phycology. 28 (6), 3331-3341 (2016).
- Passero, M., Cragin, B., Coats, E. R., McDonald, A. G., Feris, K. Dairy Wastewaters for Algae Cultivation, Polyhydroxyalkanote Reactor Effluent Versus Anaerobic Digester Effluent. BioEnergy Research. 8 (4), 1647-1660 (2015).
- Hodgskiss, L. H., Nagy, J., Barnhart, E. P., Cunningham, A. B., Fields, M. W. Cultivation of a native alga for biomass and biofuel accumulation in coal bed methane production water. Algal Research. 19, 63-68 (2016).
- Gao, C., et al. Oil accumulation mechanisms of the oleaginous microalga Chlorella protothecoides revealed through its genome, transcriptomes, and proteomes. BMC Genomics. 15, (2014).
- Burch, A. R., Franz, A. K. Combined nitrogen limitation and hydrogen peroxide treatment enhances neutral lipid accumulation in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Bioresource Technology. 219, 559-565 (2016).
- Brennan, L., Owende, P. Biofuels from microalgae–A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable Sustainable Energy Reviews. 14 (2), 557-577 (2009).
- Branyikova, I., et al. Microalgae – Novel highly efficient starch producers. Biotechnology and Bioengineering. 108 (4), 766-776 (2010).
- Chalima, A., et al. Utilization of Volatile Fatty Acids from Microalgae for the Production of High Added Value Compounds. Fermentation. 3 (4), (2017).
- Harun, R., Singh, M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (3), 1037-1047 (2010).
- Liu, L., et al. Development of a new method for genetic transformation of the green alga Chlorella ellipsoidea. Molecular biotechnology. 54 (2), 211-219 (2013).
- Cheng, J., et al. Mutate Chlorella sp. by nuclear irradiation to fix high concentrations of CO2. Bioresource Technology. 136, 496-501 (2013).
- Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production. Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).
- Sales, C. M., Au, Comparison of Scale in a Photosynthetic Reactor System for Algal Remediation of Wastewater. Journal of Visualized Experiments. (121), e55256 (2017).
- Higgins, B. T., et al. Cofactor symbiosis for enhanced algal growth, biofuel production, and wastewater treatment. Algal Research. 17, 308-315 (2016).
- Higgins, B., et al. Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater. Nature Clean Water. 1 (6), (2017).
- Higgins, B. T., et al. Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes. Algal Research. 33, 197-208 (2018).
- Lépinay, A., et al. First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting. Algal Research. 31, 395-405 (2018).
- Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate. Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).
- Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations. Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).
- Higgins, B., VanderGheynst, J. Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors. PLoS One. 9 (5), e96807 (2014).
- Higgins, B., Thornton-Dunwoody, A., Labavitch, J. M., VanderGheynst, J. S. Microplate assay for quantitation of neutral lipids in extracts from microalgae. Analytical Biochemistry. 465, 81-89 (2014).
- Tanadul, O. U., Vandergheynst, J. S., Beckles, D. M., Powell, A. L., Labavitch, J. M. The impact of elevated CO2 concentration on the quality of algal starch as a potential biofuel feedstock. Biotechnology and Bioengineering. 111 (7), 1323-1331 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Higgins, B. T., et al. Informatics for improved algal taxonomic classification and research: A case study of UTEX 2341. Algal Research. 12, 545-549 (2015).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. . Biochemistry. , 578-730 (2012).
- de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -. P., Bashan, Y. Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater. Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).
- Wang, Q., Higgins, B., Ji, H., Zhao, D. . Annual International Meeting of the ASABE. , (2018).
