Imagem latente confocal de RNA Double-Stranded e receptores de reconhecimento padrão na infecção pelo vírus de RNA de sentido negativo
Summary
Double-stranded do RNA produzido durante a replicação de vírus de RNA pode ser reconhecido por receptores de reconhecimento padrão para induzir uma resposta imune inata. Para vírus de RNA de sentido negativo, a interação entre o baixo nível de dsRNA e PRRs permanece obscura. Nós desenvolvemos um método de microscopia confocal para visualizar dsRNA arenavírus e PRR em células individuais.
Abstract
(Ds) do RNA double-stranded é produzido como um intermediário replicative durante a infecção de vírus de RNA. Reconhecimento do dsRNA por receptores de reconhecimento de padrão anfitrião (PRRs) tais como o ácido retinoico (RIG-eu) como receptores (RLRs) RIG-eu e o melanoma proteína associada a diferenciação 5 (MDA-5) leva para a indução da resposta imune inata. A formação e a distribuição intracelular de dsRNA positivo-infecção por vírus de RNA de sentido tem sido bem caracterizada por microscopia. Muitos vírus de RNA de sentido negativo, incluindo alguns arenaviruses, desencadear a resposta imune inata durante a infecção. No entanto, vírus de RNA de sentido negativo foram pensados para produzir baixos níveis de dsRNA, que impede o estudo da imagem do reconhecimento do PRR do dsRNA viral. Além disso, experimentos de infecção com alta patogenicidade arenaviruses devem ser realizados em instalações de alta contenção biossegurança nível (BSL-4). A interação entre viral RNA e PRRs para alta patogenicidade vírus RNA é desconhecida devido os desafios técnicos adicionais que os investigadores precisam enfrentar nas instalações da BSL-4. Recentemente, um anticorpo monoclonal (Mab) (clone 9 5) originalmente usado para detecção de pan-enterovírus foi encontrado para detectar especificamente dsRNA com uma maior sensibilidade do que os tradicionais anticorpos anti-dsRNA J2 ou K1. Neste documento, utilizando o 9 5 anticorpo, descrevemos um protocolo de microscopia confocal que tem sido usado com sucesso para visualizar dsRNA, proteína viral e PRR simultaneamente em células individuais, infectados por arenavírus. O protocolo é também adequado para estudos de dsRNA e distribuição do PRR em células patogênicas arenavírus infectado em instalações de BSL4 de imagem.
Introduction
O passo inicial da indução da resposta imune inata é acolhimento reconhecimento de double-stranded do RNA (ds) por receptores de reconhecimento padrão (PRRs) tais como o ácido retinoico (RIG-eu) como receptores (RLRs) RIG-eu e o melanoma associada a diferenciação proteína 5 (MDA-5)1. Para vírus de RNA de sentido positivo, dsRNA pode geralmente ser prontamente detectado usando o J2 ou K1 anti-dsRNA antibodies monoclonal (Mab)2. Interação entre dsRNA e PRRs em vírus de RNA positivo-vertente, como picornavírus, tem sido caracterizada utilizando microscopia confocal3. No entanto, para vírus de RNA sentido negativo, visualização e caracterização do PRR e dsRNA interação tem sido dificultado pela ausência de anticorpos sensíveis ao dsRNA. Hibridação in situ fluorescente (FISH) de RNA foi aplicada para a visualização de viral RNA e PRRs4. No entanto, a metodologia de peixe requer o conhecimento do destino sequência de RNA e pode não ser compatível com PRR co coloração. Recentemente, a 5 de 9 Mab, que foi originalmente desenvolvido para o diagnóstico da infecção por enterovírus-pan, foi encontrado para ser mais sensível do que o Mab J2 e pode facilmente detectar dsRNA no sentido negativo de5,de infecção de vírus de RNA6. Assim, o Mab 9 5 é um romance e uma ferramenta útil para estudar a replicação viral e a interação entre o PRR e o RNA viral para vírus de RNA sentido negativo.
Arenaviruses é uma família de vírus de RNA de single-stranded, negativo-sentido, que inclui vários agentes patogénicos humanos, tais como vírus de Lassa (LASV), vírus Junín (JUNV) e vírus Machupo (MACV), que causam doenças graves de febre hemorrágica em seres humanos7. Dados clínicos de casos graves e fatais de febre hemorrágica Argentina causada por arenavírus do novo mundo JUNV apresentam níveis anormalmente altos de soro IFN-α8,9. Mostramos que o arenaviruses NW patogénicos (JUNV e MACV), mas não a patogenicidade velho mundo arenavírus, LASV, induzem um tipo eu resposta de interferon (IFN) em humanos células dendríticas derivadas de monócitos10. Além disso, RIG-I é um dos sensores mediando tipo I resposta IFN em células infectadas JUNV11. Também achamos que o receptor de R (PKR) proteína quinase, que é tradicionalmente conhecido por reconhecimento de dsRNA, é ativado em patogenicidade NW arenavírus infecção12. Para entender melhor o mecanismo de resposta IFN vírus específicos durante a infecção arenavírus, visamos desenvolver um protocolo para visualizar a interação entre dsRNA viral e os PRRs citoplasmáticas.
Experimentos de infecção com patogenicidade JUNV, MACV e LASV precisam ser executada em Biossegurança nível 4 instalações (BSL-4). Assim, além do nível baixo presumivelmente de dsRNA formado na infecção por arenavírus, cumprindo as exigências de biossegurança é outro desafio técnica ao realizar estudos de imagiologia para estes vírus de alta patogenicidade. Utilizando o 9 5 anticorpo e Candid1 # estirpe utilizada na vacina de JUNV, um protocolo baseado em microscopia confocal é descrito neste relatório, que tem sido usada com sucesso para visualizar dsRNA, proteína viral e PRR simultaneamente em células infectadas por arenavírus em BSL2 laboratórios. O protocolo é também adequado para visualização da distribuição intracelular de dsRNA e PRR durante infecção patogénica arenavírus em instalações de BSL4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para vírus de RNA de sentido positivo e vírus dsDNA, dsRNA é facilmente detectado com o anticorpo utilizado de anti-dsRNA J2. No entanto, vírus de RNA de sentido negativo acredita-se que produzem o dsRNA em uma baixa ou abaixo do nível de detecção, usando o mesmo anticorpo2. Assim, muitos aspectos da interação viral do RNA e PRR são em grande parte obscuro para vírus de RNA de sentido negativo. Buscou-se mancha para dsRNA na infecção por arenavírus usando o anticorpo J2 mas os sinais…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer o UTMB imagem núcleo instalações e Maxim Ivannikov para assistência de microscópio.
Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública conceder RO1AI093445 e RO1AI129198 para SP, premiado UTMB compromisso fundo P84373 de CH e T32 AI007526 para EM.
Materials
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6 (2006).
- Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
- Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031 (2012).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. 2, (2006).
- Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
- Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
- Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
- Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).
- Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20 (2017).
- Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
- Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6 (2018).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
