Konfokale Abbildung von Double-Stranded RNA und Muster Anerkennung Rezeptoren im negativen Sinn-RNA-Virusinfektion
Summary
Doppelsträngige RNA produziert während der RNA-Virus-Replikation man Muster Anerkennung Rezeptoren erkennt an eine angeborene Immunantwort zu induzieren. Für negativ-Sense-RNA-Viren bleibt die Interaktion zwischen dem Low-Level-DsRNA und PRRs unklar. Wir haben eine Methode konfokalen Mikroskopie Arenavirus DsRNA und PRR in einzelnen Zellen visualisieren entwickelt.
Abstract
Double-Stranded (ds) RNA wird als replikative Intermediate während RNA-Virus-Infektion hergestellt. Anerkennung von DsRNA von Host-Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRRs) wie die Retinsäure (RIG-ich) wie Rezeptoren (RLRs) RIG-I und Melanom Differenzierung-assoziierten Protein 5 (MDA-5) führt zur Induktion der angeborenen Immunantwort. Die Bildung und intrazelluläre Verteilung von DsRNA in positiv-Sense RNA-Virus-Infektion wurden gut charakterisiert, durch Mikroskopie. Viele negativ-Sense-RNA-Viren, einschließlich einige Arenaviruses auslöst der angeborenen Immunantwort, während Infektion. Negativ-Sense-RNA-Viren galten jedoch geringe Mengen an DsRNA, zu produzieren, die die bildgebende Untersuchung der PRR Anerkennung der viralen DsRNA behindert. Darüber hinaus müssen Infektions-Experimente mit hoch pathogenen Arenaviruses in high Containment Biosafety Level Einrichtungen (BSL-4) durchgeführt werden. Die Interaktion zwischen viralen RNA und PRRs für hoch pathogenen Virus RNA ist weitgehend unbekannt, aufgrund der zusätzlichen technischen Herausforderungen, die Forscher in den BSL-4-Anlagen stellen müssen. Vor kurzem fand ein monoklonaler Antikörper (Mab) (Klon 9 5) ursprünglich für Pan-Enterovirus-Erkennung verwendet speziell DsRNA mit eine höhere Empfindlichkeit als die traditionellen J2 oder K1 Anti-DsRNA Antikörper erkennen. Hierin, durch die Verwendung der 9 5 Antikörper, beschreiben wir ein konfokalen Mikroskopie-Protokoll, das erfolgreich verwendet wurde, um DsRNA, virale Proteine und PRR gleichzeitig in einzelnen Zellen infiziert durch Arenavirus visualisieren. Das Protokoll eignet sich auch für die bildgebenden Verfahren der DsRNA und PRR Verteilung in pathogenen Arenavirus infizierte Zellen in BSL4 Einrichtungen.
Introduction
Der erste Schritt der Induktion der angeborenen Immunantwort ist Host Anerkennung der Doppelstrang-RNA (ds) durch die Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRRs) wie die Retinsäure (RIG-ich) wie Rezeptoren (RLRs) RIG-I und Melanom Differenzierung verbunden Eiweiß 5 (MDA-5)1. Für positiv-Sense-RNA-Viren DsRNA in der Regel leicht zu erkennen mit dem J2 oder K1 Anti-DsRNA monoklonaler Antikörper (Mab)2. Interaktion zwischen DsRNA und PRRs in positiv-Strang-RNA-Viren, wie z. B. Picornavirus, wurde mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie3gekennzeichnet. Jedoch für negativ-Sense RNA-Virus, hat Visualisierung und Charakterisierung der PRR und DsRNA Interaktion behindert worden durch das Fehlen von sensiblen Antikörpern gegen DsRNA. RNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) wurde auf die Visualisierung der viralen RNA und PRRs4angewendet. Dennoch, die Fisch-Methode erfordert die Kenntnis des Ziels RNA-Sequenz und möglicherweise nicht kompatibel mit PRR Co beflecken. Vor kurzem, 9 5 Mab, die ursprünglich für die Diagnose von Pan-Enterovirus-Infektionen entwickelt wurde, wurde festgestellt, dass viel empfindlicher als die J2 Mab und kann ohne weiteres erkennen DsRNA in negativ-Sense RNA-Virus-Infektion5,6. Mab 9 5 ist eine neuartige und nützliches Werkzeug, um die virale Replikation und die Interaktion zwischen PRR und virale RNA für negativ-Sense RNA-Virus zu studieren.
Arenaviruses sind eine Familie von einsträngige, negativ-Sense RNA-Viren, darunter mehrere humanpathogene Erreger wie Lassa Virus (LASV), Junin-Virus (JUNV) und Machupo-Virus (MACV), die schwere hämorrhagische Fieber Krankheiten im Menschen7verursachen. Klinische Daten von schwere und tödliche Fälle von argentinischen hämorrhagisches Fieber verursacht durch die neue Welt Arenavirus JUNV weisen ungewöhnlich hohe Serum IFN-α8,9. Wir haben gezeigt, dass die pathogenen NW-Arenaviruses (JUNV und MACV), aber nicht die pathogenen alten Welt Arenavirus, LASV, eine Art induzieren ich Interferon (IFN) Antwort in menschliche Monocyte-abgeleitete dendritische Zellen10. Darüber hinaus RIG-I ist einer der Sensoren Vermittlung Typ I IFN Antwort im JUNV-infizierten Zellen11. Wir fanden auch, dass der Protein Kinase R (PKR) Rezeptor, die traditionell für DsRNA Anerkennung bekannt ist, in pathogenen NW Arenavirus Infektion12aktiviert ist. Um den Mechanismus des Virus-spezifischen IFN Antwort während Arenavirus Infektion besser zu verstehen, wollten wir ein Protokoll, um die Interaktion zwischen viralen DsRNA und zytoplasmatischen PRRs visualisieren zu entwickeln.
Infektions-Experimente mit pathogenen JUNV, MACV und LASV in biologische Sicherheit erfüllt werden müssen Stufe 4 (BSL-4) Einrichtungen. So ist neben der vermutlich geringen DsRNA Arenavirus Infektion gegründet, den biologischen Anforderungen eine weitere Technik Herausforderung bei bildgebenden Untersuchungen für diese hoch pathogenen Viren. Durch die Verwendung der 9 5 Antikörper und die Candid1 # Impfstamm des JUNV, einem konfokalen Mikroskopie-basiertes Protokoll ist beschrieben in diesem Bericht wurde erfolgreich zur DsRNA, virale Proteine und PRR in durch Arenavirus in infizierten Zellen gleichzeitig visualisieren BSL2 Labs. Das Protokoll ist auch geeignet für die Visualisierung der intrazelluläre Verteilung von DsRNA und PRR während Pathogene Arenavirus Infektion in BSL4 Einrichtungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für positiv-Sense-RNA-Viren und Viren DsDNA wird DsRNA leicht mit dem weit verbreiteten J2 Anti-DsRNA Antikörper erkannt. Allerdings sind negativ-Sense-RNA-Viren vermutlich DsRNA auf einem niedrigen oder unter die Nachweisgrenze mit dem gleichen Antikörper2zu produzieren. So sind viele Aspekte der viralen RNA und PRR Interaktion für negativ-Sense-RNA-Viren weitgehend unklar. Wir färben für DsRNA Arenavirus Infektion mit der J2-Antikörper versucht aber die Fluoreszenz-Signale wurden nicht di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten den UTMB imaging Core Einrichtungen und Maxim Ivannikov für Mikroskop Unterstützung bedanken.
Diese Arbeit wurde unterstützt von Public Health Service gewähren, RO1AI093445 und RO1AI129198 ausgezeichnet zu SP, UTMB Engagement Fonds P84373, CH und T32 AI007526 em.
Materials
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
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