Confocale beeldvorming van Double-Stranded RNA en patroon erkenning receptoren in negatief-Sense RNA-virusinfectie
Summary
Double-stranded RNA geproduceerd tijdens de replicatie van RNA-virus kan worden herkend door patroon erkenning receptoren voor het opwekken van een aangeboren immuunrespons. Voor negatieve-gevoel van RNA-virussen blijft de interactie tussen de low-level dsRNA en PRRs onduidelijk. We hebben een confocale microscopie methode ontwikkeld om visualiseren Arenavirussen dsRNA en PRR in afzonderlijke cellen.
Abstract
Double-stranded (ds) RNA wordt geproduceerd als Dr. intermediair tijdens de RNA-virusinfectie. Erkenning van dsRNA door gastheer patroon erkenning receptoren (PRRs) zoals de retinoïnezuur (RIG-ik) als receptoren (RLRs) RIG-ik en melanoom differentiatie-geassocieerde eiwit 5 (MDA-5) leidt tot de inductie van de aangeboren immuunrespons. De vorming en de intracellulaire distributie van dsRNA in positieve-zin RNA-virusinfectie was ook gekenmerkt door microscopie. Veel negatieve-gevoel van RNA-virussen, met inbegrip van sommige arenaviruses, activeren de ingeboren immune reactie tijdens infectie. Echter werden negatief-gevoel van RNA-virussen verondersteld om het produceren van lage niveaus van dsRNA, die de beeldvorming studie van PRR erkenning van virale dsRNA belemmert. Bovendien moeten de infectie experimenten met hoogpathogene arenaviruses in hoge insluiting bioveiligheid niveau voorzieningen (BSL-4) worden uitgevoerd. De interactie tussen virale RNA en PRRs voor hoogpathogene RNA-virus is grotendeels onbekend als gevolg van de extra technische uitdagingen dat onderzoekers moeten onder ogen zien in de BSL-4 faciliteiten. Onlangs, een monoklonaal antilichaam (Mab) (kloon 9D 5) oorspronkelijk gebruikt voor pan-enterovirus detectie is gebleken dat specifiek dsRNA detecteren met een hogere gevoeligheid dan de traditionele J2 of K1 anti-dsRNA antilichamen. Hierin, door gebruik te maken van de 9D 5 antilichaam, beschrijven we een confocale microscopie-protocol dat met succes heeft gebruikt om te visualiseren dsRNA, virale eiwitten en PRR gelijktijdig in afzonderlijke cellen besmet door Arenavirussen. Het protocol is ook geschikt voor imaging studies van dsRNA en PRR distributie in pathogene Arenavirussen geïnfecteerde cellen in BSL4 faciliteiten.
Introduction
De eerste stap van de inductie van de aangeboren immuunrespons is host erkenning van double-stranded RNA (ds) door de patroon erkenning receptoren (PRRs) zoals de retinoïnezuur (RIG-ik) als receptoren (RLRs) RIG-ik en melanoom differentiatie-geassocieerde eiwit 5 (MDA-5)1. Voor positieve-gevoel van RNA-virussen, kan dsRNA meestal worden gemakkelijk opgespoord met behulp van de J2 of K1 anti-dsRNA monoclonal antilichamen (Mab)2. Interactie tussen dsRNA en PRRs in positieve-onderdeel van RNA-virussen, zoals picornavirus, heeft gekenmerkt met behulp van de confocal microscopie3. Echter voor negatieve verstand RNA-virus, werd visualisatie en karakterisering van PRR en dsRNA interactie belemmerd door het ontbreken van gevoelige antilichamen tegen dsRNA. RNA Fluorescente kruising in situ (vissen) is toegepast op de visualisatie van virale RNA en PRRs4. Niettemin, de vis-methodologie vereist de kennis van de doelgroep opeenvolging van RNA en is mogelijk niet compatibel met PRR mede kleuring. Onlangs, de 9D 5 Mab, die oorspronkelijk werd ontwikkeld voor de diagnose van pan-enterovirus infectie, bleek te zijn gevoeliger dan de J2 Mab en kan gemakkelijk detecteren dsRNA in negatief-zin RNA-virus infectie5,6. Mab 9D 5 is dus een roman en een nuttig instrument om te studeren van virale replicatie en de interactie tussen PRR en virale RNA voor negatieve-sense RNA-virus.
Arenaviruses is een familie van single-stranded, negatief-gevoel van RNA-virussen, waaronder verschillende menselijke pathogenen, zoals Lassa-virus (LASV), Junín virus (JUNV) en Machupo-virus (MACV), waardoor ernstige hemorragische koorts ziekten in mens7. Klinische gegevens uit ernstige en dodelijke gevallen van Argentijnse hemorragische koorts veroorzaakt door de nieuwe wereld Arenavirussen JUNV vertonen ongewoon hoge niveaus van serum IFN-α8,9. We hebben aangetoond dat de pathogene NW-arenaviruses (JUNV en MACV), maar niet de pathogene vliegenvangers Arenavirussen, LASV, een type veroorzaken ik interferon (IFN) antwoord in menselijke monocyt-afgeleide dendritische cellen10. Bovendien, RIG-behoort van de sensoren bemiddelen typ ik IFN antwoord in JUNV-geïnfecteerde cellen11. We vonden ook dat de proteïne kinase R (PKR) receptor, die traditioneel bekend voor dsRNA erkenning staat, wordt geactiveerd in pathogene NW Arenavirussen infectie12. Om verder te begrijpen het mechanisme van virus-specifieke IFN reactie tijdens Arenavirussen infectie, we gericht op het ontwikkelen van een protocol om de interactie tussen virale dsRNA en de cytoplasmatische PRRs visualiseren.
Infectie experimenten met pathogene JUNV, MACV en LASV moeten worden uitgevoerd in de bioveiligheid niveau 4 (BSL-4) voorzieningen. Dus, naast het vermoedelijk lage niveau van dsRNA gevormd in Arenavirussen infectie, voldoen aan de eisen van de bioveiligheid is een andere techniek uitdaging bij het uitvoeren van imaging studies voor deze hoogpathogene virussen. Door gebruik te maken van de 9D 5 antilichaam en de Candid1 # vaccinstam van JUNV, een confocal microscopie gebaseerde protocol wordt beschreven in dit verslag, dat met succes heeft gebruikt om te visualiseren dsRNA, virale eiwitten en PRR gelijktijdig in cellen besmet door Arenavirussen in BSL2 labs. Het protocol is ook geschikt voor de visualisatie van intracellulaire distributie van dsRNA en PRR tijdens pathogene Arenavirussen infectie in BSL4 faciliteiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor positieve-gevoel van RNA-virussen en dsDNA virussen, is dsRNA gemakkelijk met het gebruikte J2 anti-dsRNA antilichaam ontdekt. Echter, negatief-gevoel van RNA-virussen worden verondersteld te produceren dsRNA op een laag of onder het niveau van de detectie met behulp van de dezelfde antilichaam-2. Dus zijn veel aspecten van de virale RNA en PRR interactie grotendeels onduidelijk voor negatieve-gevoel van RNA-virussen. We geprobeerd om vlek voor dsRNA in Arenavirussen infectie met behulp van h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij wil bedanken de UTMB imaging core faciliteiten en Maxim Ivannikov voor de bijstandsverlening van de Microscoop.
Dit werk werd gesteund door de Public Health Service verlenen RO1AI093445 en RO1AI129198 toegekend aan SP, UTMB inzet Fonds P84373 aan CH en T32 AI007526 naar EM.
Materials
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6 (2006).
- Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
- Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031 (2012).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. 2, (2006).
- Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
- Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
- Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
- Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).
- Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20 (2017).
- Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
- Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6 (2018).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
