גישות התנהגותיות לחקר הלחץ הטבוע בדג זברה
Summary
כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה למדוד מתח במהלך הפעולה במהלך בגרות דג מבוגר. הגישה מנצלת את הנטייה הטבועה שדגים מעדיפים את החצי התחתון של הטנק כאשר במצב מלחיץ. כמו כן, אנו מתארים שיטות לזיווג עם פרמקולוגיה.
Abstract
מגיבים בהתאם לגירויים מלחיצים חיוני להישרדות של אורגניזם. מחקר נרחב נעשה על מגוון רחב של מחלות הקשורות למתח והפרעות פסיכיאטריות, אך מחקרים נוספים לתוך הרגולציה הגנטית והעצבית של הלחץ עדיין נדרשים לפתח therapeutics טוב יותר. הדג מספק מודל גנטי רב עוצמה כדי לחקור את הגבולות העצביים של מתח, כפי שקיים אוסף גדול של קווי מוטציה וטרנסגניים. יתר על כן, פרמקולוגיה יכולה בקלות להיות מיושם על דג zebrafish, כמו רוב התרופות ניתן להוסיף ישירות למים. אנו מתארים כאן את השימוש ‘ מבחן הטנק הרומן כשיטה ללמוד התגובות לחץ מולדים ב zebrafish, ולהדגים כיצד תרופות נגד חרדה פוטנציאלי יכול להיות מאומת באמצעות הבקשה. השיטה יכולה בקלות להיות ביחד עם הקווים דג זברה מחסה מוטציות גנטיות, או אלה שבהם גישות הטרנסגניים לתפעול מעגלים עצביים מדויקים משמשים. ניתן להשתמש באפשרות זו גם בדגמי דגים אחרים. ביחד, הפרוטוקול המתואר צריך להקל על אימוץ הדבר הפשוט הזה למעבדות אחרות.
Introduction
תגובות מצוקה משנות מצבים התנהגותיים ופיסיולוגיים כתוצאה מגירויים עלולים להזיק או מזיקים. תגובות הלחץ נשמרים ברחבי ממלכת החיות, והם קריטיים להישרדות של אורגניזם1. עשרות שנים של מחקר הרחיבו מאוד את הידע שלנו על חלק מהמנגנונים הגנטיים והעצביים שבבסיס מצבי הלחץ. כיום, אזורי המוח כגון האמיגדלה והסטריאטום2, וגורמים גנטיים כגון קורטיקוטרופין שחרור הורמון (crh), ו glucocorticoid (gr) ו מינרלוקורטיקואידים קולטנים ( mr) נחקרו בהרחבה3,4,5,6. למרות הממצאים הקריטיים הללו, הרבה נשאר לא ידוע על הרגולציה הגנטית והעצבית של הלחץ. ככאלה, הפרעות הנוגעות ללחץ רב סובלות ממחסור בtherapeutics.
אורגניזמים amendable מודל גנטית לספק כלי שימושי במחקר של שליטה גנטית ועצבית של התנהגות. מודלים דגים, בפרט, הם חזקים ביותר: הם אורגניזמים קטנים עם פעמים הדור הקצר, השימוש שלהם בסביבה מעבדה הוא facile, גנום שלהם הם שונה בקלות, ו, כמו בעלי חוליות, הם חולקים לא רק גנטית, אלא גם נוירואנטומי הומולוגיה עם היונקים המקבילים שלהם7,8. התקן סטנדרטי עבור מדידת לחץ יכול להיות מזווג עם שורות דג זברה מחסה מוטציות גנטיות, או אלה שבהם מניפולציה של ערכות המשנה נוירואליות מדויקת אפשרי, ואת ההשפעות של גנים בודדים או נוירונים מוגדרים ניתן להעריך במהירות וביעילות.
ביהביואורלי, התגובות לחץ יכול להיות מאופיין דגים כתקופות של היפר-פעילות או תקופות ממושכות של חוסר פעילות (בדומה “הקפאה”)9, מופחתת מחקר10, נשימה מהירה, צריכת מזון מופחת11, ומ העדפת מקום בתחתית טנק12. לדוגמה, כאשר ממוקם לתוך טנק לא מוכר, דג מבוגר ודגמים קטנים אחרים דגים להראות העדפה ראשונית למחצית התחתונה של המיכל, עדיין, לאורך זמן, הדג להתחיל לחקור את החצאים העליון והתחתון עם תדר כמעט שווה12. טיפול של מבוגרים עם תרופות הידוע כדי להפחית את החרדה לגרום דגים לחקור מיד את החלק העליון10,13. לעומת זאת, תרופות המגבירים את החרדה גורמות לדגים להפגין העדפה חזקה לחצי התחתון של המיכל12,14,15. כך, מופחתת בחיפושי והעדפה למחצית התחתונה של הטנק הם אינדיקטורים פשוטים ואמינים של מתח.
כמו רוב החוליות, התגובות המתח בדגים מונעים על ידי הפעלת היפותלמי-יותרת הכליה-אינטר-כליות ציר (hpi; מקבילה ההיפותלמי-יותרת הכליה-האדרנל [hpi] ציר יונקים)14,16. נוירונים היפותלמי המבטא הורמון קורטיקוטרופין שחרור הורמון (CRH) האות לבלוטת יותרת ההיפופיזה, אשר בתורו לשחרר אדרנוקורטיקוטרופי הורמון שחרור (ACTH). Acth לאחר מכן אותות לבלוטת הבין-כליות כדי לייצר ולהפריש קורטיזול, אשר יש מספר של מטרות במטה16, אחד מהם להיות משוב שלילי של ה-crthal, הנוירונים היפותלמי 3,17, 18,19.
כאן, אנו מתארים שיטה להערכת אמצעים התנהגותיים של הלחץ הטבוע. לגבי ההתנהגות, אנו מפרטים פרוטוקולים באמצעות בדיקת הטנק הרומן צולל12,14. לאחר מכן אנו מדגימים, כדוגמה, כי תרופה נגד חרדה מוכרת, בוטרון, מפחיתה את צעדי ההתנהגות של הלחץ.
Protocol
Representative Results
Discussion
זברפיש מפגין תגובת מתח חזקה במיכל הרומן
כאן, אנו מתארים גישה התנהגותית פשוטה לבדיקת התגובות המתח של zebrafish מבוגרים, ולאמת את הגישה כמדד פשוט של הלחץ באמצעות פרמקולוגיה.
מבחן טנק הרומן הוא מבחן בשימוש נרחב לבדיקת מתחים מולדים ב-דג זברה ומינים אחרים של דגים12…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי מימון מיוזמת יופיטר למדעי החיים באוניברסיטת פלורידה אטלנטיק. עבודה זו היתה נתמכת גם על ידי מענקים R21NS105071 (הוענק ACK ו-הורד) ו R15MH118625 (הוענק ל-למטה) מן המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| Camera | We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics. | ||
| Infrared filter | Edmund Optics | ||
| Video Acquisition Program | Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set. | ||
| Infrared LED lights | |||
| Assay tank | Aquaneering | Part number ZT180 | Size: M3 1.8 liter |
| Stand and clamp, or standard tripod for camera | |||
| 250mL beaker | |||
| Tracking software | We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology | ||
| Buspirone chloride | Sigma-Aldrich | B7148 | |
| Randomized trial generator | We use the RANDBETWEEN function in Microsoft Excel |
References
- McEwen, B. S. Stress, adaptation, and disease. Allostasis and allostatic load. Annals of the New York Academy of Sciences. 840, 33-44 (1998).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Facchinello, N., et al. Nr3c1 null mutant zebrafish are viable and reveal DNA-binding-independent activities of the glucocorticoid receptor. Scientific Reports. 7 (4371), (2017).
- Ziv, L., et al. An affective disorder in zebrafish with mutation of the glucocorticoid receptor. Molecular Psychiatry. , (2013).
- Grone, B. P., Maruska, K. P. Divergent evolution of two corticotropin-releasing hormone (CRH) genes in teleost fishes. Frontiers in Neuroscience. , (2015).
- Fuller, P. J., Lim-Tio, S. S., Brennan, F. E. Specificity in mineralocorticoid versus glucocorticoid action. Kidney International. , (2000).
- Zhdanova, I. V. Sleep and its regulation in zebrafish. Reviews in the Neurosciences. 22 (1), 27-36 (2011).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. , (2001).
- Duboué, E. R. E. R., Hong, E., Eldred, K. C. K. C., Halpern, M. E. M. E. Left Habenular Activity Attenuates Fear Responses in Larval Zebrafish. Current Biology. 27 (14), 2154-2162 (2017).
- Facchin, L., Duboue, E. R., Halpern, M. E. Disruption of Epithalamic Left-Right Asymmetry Increases Anxiety in Zebrafish. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15847-15859 (2015).
- Øverli, &. #. 2. 1. 6. ;., Sørensen, C., Nilsson, G. E. Behavioral indicators of stress-coping style in rainbow trout: Do males and females react differently to novelty. Physiology and Behavior. , (2006).
- Levin, E. D., Bencan, Z., Cerutti, D. T. Anxiolytic effects of nicotine in zebrafish. Physiology & behavior. 90 (1), 54-58 (2007).
- Bencan, Z., Sledge, D., Levin, E. D. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 94 (1), 75-80 (2009).
- Cachat, J., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nature Protocols. 5 (11), 1786-1799 (2010).
- Mathuru, A. S., et al. Chondroitin fragments are odorants that trigger fear behavior in fish. Current Biology. , (2012).
- Alsop, D., Vijayan, M. The zebrafish stress axis: Molecular fallout from the teleost-specific genome duplication event. General and Comparative Endocrinology. , (2009).
- Evans, A. N., Liu, Y., MacGregor, R., Huang, V., Aguilera, G. Regulation of Hypothalamic Corticotropin-Releasing Hormone Transcription by Elevated Glucocorticoids. Molecular Endocrinology. , (2013).
- Fenoglio, K. A., Brunson, K. L., Avishai-Eliner, S., Chen, Y., Baram, T. Z. Region-specific onset of handling-induced changes in corticotropin- releasing factor and glucocorticoid receptor expression. Endocrinology. , (2004).
- Liposits, Z., et al. Ultrastructural localization of glucocorticoid receptor (GR) in hypothalamic paraventricular neurons synthesizing corticotropin releasing factor (CRF). Histochemistry. , (1987).
- Facchin, L., Duboué, E. R., Halpern, M. E. Disruption of epithalamic left-right asymmetry increases anxiety in Zebrafish. Journal of Neuroscience. 35 (48), (2015).
- Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
- Wong, K., et al. Analyzing habituation responses to novelty in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 208 (2), 450-457 (2010).
- Matsunaga, W., Watanabe, E. Habituation of medaka (Oryzias latipes) demonstrated by open-field testing. Behavioural Processes. 85 (2), 142-150 (2010).
- Walker, C. Chapter 3 Haploid Screens and Gamma-Ray Mutagenesis. Methods in Cell Biology. , (1998).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327, 348-351 (2010).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2010).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39 (3), 255-261 (2006).
- Gammans, R. E., et al. Use of buspirone in patients with generalized anxiety disorder and coexisting depressive symptoms. A meta-analysis of eight randomized, controlled studies. Neuropsychobiology. 25 (4), 193-201 (1992).
- Maaswinkel, H., Zhu, L., Weng, W. The immediate and the delayed effects of buspirone on zebrafish (Danio rerio) in an open field test: A 3-D approach. Behavioural Brain Research. , (2012).
- Gebauer, D. L., et al. Effects of anxiolytics in zebrafish: Similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and ethanol. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2011).
- Maximino, C., et al. Fingerprinting of psychoactive drugs in zebrafish anxiety-like behaviors. PLoS ONE. , (2014).
- Horváth, J., Barkóczi, B., Müller, G., Szegedi, V. Anxious and nonanxious mice show similar hippocampal sensory evoked oscillations under urethane anesthesia: Difference in the effect of buspirone. Neural Plasticity. , (2015).
- Costall, B., Kelly, M. E., Naylor, R. J., Onaivi, E. S. Actions of buspirone in a putative model of anxiety in the mouse. Pharm Pharmacol. 40 (7), 494-500 (1988).
- Barros, M., Mello, E. L., Huston, J. P., Tomaz, C. Behavioral effects of buspirone in the marmoset employing a predator confrontation test of fear and anxiety. Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2001).
- Heinen-Kay, J. L., et al. Predicting multifarious behavioural divergence in the wild. Animal Behaviour. 121, 3-10 (2016).
- Thompson, R. R. J., Paul, E. S., Radford, A. N., Purser, J., Mendl, M. Routine handling methods affect behaviour of three-spined sticklebacks in a novel test of anxiety. Behavioural Brain Research. 306, 26-35 (2016).
- Hamilton, T. J., et al. Establishing zebrafish as a model to study the anxiolytic effects of scopolamine. Scientific Reports. , (2017).
- York, R. A., Fernald, R. D. The Repeated Evolution of Behavior. Frontiers in Ecology and Evolution. 4, 143 (2017).
- Jakka, N. M., Rao, T. G., Rao, J. V. Locomotor behavioral response of mosquitofish (Gambusia affinis) to subacute mercury stress monitored by video tracking system. Drug and Chemical Toxicology. , (2007).
- Hu, C. K., Brunet, A. The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause. Aging Cell. , (2018).
- Maximino, C., et al. Measuring anxiety in zebrafish: A critical review. Behavioural Brain Research. 214 (2), 157-171 (2010).
- Maximino, C., Marques de Brito, T., Dias, C. A. G., Gouveia, A., Morato, S. Scototaxis as anxiety-like behavior in fish. Nature protocols. 5 (2), 209-216 (2010).
- Godwin, J., Sawyer, S., Perrin, F., Oxendine, S., Kezios, Z. Adapting the Open Field Test to assess anxiety related behavior in zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. , 181-189 (2012).
- Agetsuma, M., et al. The habenula is crucial for experience-dependent modification of fear responses in zebrafish. Nature Neuroscience. 13 (11), 1354-1356 (2010).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning and Memory. , (2012).
- Baker, M. R., Goodman, A. C., Santo, J. B., Wong, R. Y. Repeatability and reliability of exploratory behavior in proactive and reactive zebrafish, Danio rerio. Scientific Reports. , (2018).
- Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. , 7 (2013).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
- Marquart, G. D., et al. A 3D Searchable Database of Transgenic Zebrafish Gal4 and Cre Lines for Functional Neuroanatomy Studies. Frontiers in Neural Circuits. , (2015).
- Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nature Methods. 12 (11), 1039-1046 (2015).
- Gupta, T., et al. Morphometric analysis and neuroanatomical mapping of the zebrafish brain. Methods. 1046 (18), 30011-30012 (2018).
- Marquart, G. D., et al. High-precision registration between zebrafish brain atlases using symmetric diffeomorphic normalization. GigaScience. , (2017).
- Ronneberger, O., et al. ViBE-Z: A framework for 3D virtual colocalization analysis in zebrafish larval brains. Nature Methods. , (2012).
- Subedi, A., et al. Adoption of the Q transcriptional regulatory system for zebrafish transgenesis. Methods. 66 (3), 433-440 (2014).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Chatterjee, D., Tran, S., Shams, S., Gerlai, R. A Simple Method for Immunohistochemical Staining of Zebrafish Brain Sections for c-fos Protein Expression. Zebrafish. , (2015).
