Fagocitosi del macrofago alveolare e la Clearance di batteri nei topi
Summary
Qui segnaliamo i metodi comuni per analizzare la funzione fagocitica dei macrofagi alveolari murini e lo spazio batterico dal polmone. Questi metodi di studio in vitro fagocitosi dei branelli di isotiocianato di fluorescina e fagocitosi in vivo di Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Inoltre descriviamo un metodo per l’eliminazione di p. aeruginosa nei topi.
Abstract
I macrofagi alveolari (ma) guardia spazio alveolare del polmone. Fagocitosi di AMs svolge un ruolo critico nella difesa contro l’invasione di agenti patogeni, la rimozione delle cellule morte o particelle estranee e nella risoluzione della risposta infiammatoria e rimodellamento del tessuto, i processi che sono mediati dai vari recettori di superficie di L’AMs. Qui, segnaliamo i metodi per l’analisi della funzione fagocitica di AMs utilizzando saggi in vitro e in vivo e strategie sperimentali per differenziare il modello riconoscimento del recettore – complemento recettore- e Fc gamma ricevitore-mediata fagocitosi. Infine, si discute un metodo per stabilire e caratterizzare un modello di polmonite di p. aeruginosa nei topi per valutare la clearance batterica in vivo. Questi saggi rappresentano i metodi più comuni per valutare le funzioni AM e possono anche essere utilizzati per studiare la funzione del macrofago e lo spazio batterico in altri organi.
Introduction
AMs sono i fagociti residenti principali negli alveoli in fase di riposa e uno dei principali attori della risposta immunitaria innata attraverso il riconoscimento e interiorizzazione degli agenti patogeni per via inalatoria e particelle estranee1,2. È stato segnalato che AMs sono essenziali per la rapida clearance di molti agenti patogeni polmonari come p. aeruginosa e Klebsiella polmonite3,4, quindi una carenza nella fagocitosi AM si traduce spesso in respiratoria infezioni, come la polmonite acuta, che causano più alti tassi di mortalità e morbosità.
AMs anche avviare le risposte infiammatorie innate nel polmone con la produzione di citochine e chemochine come TNF-α e IL-1 β, quale area interattiva con altre cellule dell’ambiente alveolare per produrre chemochine e reclutare infiammatori neutrofili, monociti, e cellule immuni adattive nel polmone5. Per esempio, IL-1 β prodotto da AMs aiuta per innescare il rilascio di neutrofili chemochina CXCL8 da cellule epiteliali6. Inoltre, AMs contribuiscono alla fagocitosi di apoptotic leucociti polimorfonucleari (PMNs), di che conduce alla perdita sostenuta di enzimi intracellulari da PMNs mancato il tessuto circostante, con conseguente danno tissutale e l’infiammazione prolungata 7 , 8 , 9.
Fagocitosi di AMs sono mediato da un diretto riconoscimento di pattern molecolari associati alla superficie dell’agente patogeno da recettori di riconoscimento di pattern (PRRs) dell’AMs o dall’associazione di agenti patogeni opsonized con i recettori immuni effettrici dell’AMs 10. per quest’ultimo, AMs può riconoscere i bersagli opsonized con immunoglobuline (IgG) attraverso i loro recettori Fcy (FcγR) o gli agenti patogeni rivestiti con frammenti di complemento, C3b e C3bi, attraverso i loro recettori del complemento (CR)11. Tra i recettori del complemento, il CR della superfamiglia delle immunoglobuline (CRIg) è espressa selettivamente nel tessuto macrofagi12, e una recente scoperta ha evidenziato il ruolo di CRIg nella fagocitosi AM nel contesto della polmonite di p. aeruginosa 13.
Molti studi originali utilizzano metodi per valutare la fagocitosi del macrofago per descrivere i meccanismi molecolari del macrofago funzione14,15. Tuttavia, i metodi come fagocitosi in vivo richiedono una precisa quantificazione della fagocitosi. Qui, riassumiamo una metodologia dettagliata per fagocitosi sia in vitro che in vivo utilizzando isotiocianato di fluorescina (FITC)-microsfere di vetro e proteina di p. aeruginosa verde fluorescente (GFP), rispettivamente. Inoltre, spieghiamo il metodo della differenziazione fra PRR-, CR- e fagocitosi mediata da FcγR. Infine, segnaliamo un metodo per caratterizzare lo spazio batterico nel topo rispetto alla polmonite di p. aeruginosa .
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante l’esecuzione di una funzione di scambio di gas, il polmone si confronta con insistenza allergeni, agenti patogeni e particelle estranee. AMs rappresentano la prima linea di difesa in virtù della loro funzione principale, vale a dire la fagocitosi. AMs anche coordinare con altre cellule immuni a distruggere gli agenti patogeni e nella risoluzione di infiammazione. Qui, abbiamo descritto metodi per valutare specificamente la fagocitosi di AMs isolato dal polmone del topo. Il protocollo presentato in questo manoscr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da grant R01HL116826 a X. Zhao.
Materials
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
