Alveolären Makrophagen Phagozytose und Bakterien-Clearance bei Mäusen
Summary
Hier berichten wir über gemeinsame Methoden für die Analyse der phagocytic Funktion der murinen alveolären Makrophagen und bakterielle Freiraum aus der Lunge. Diese Methoden studieren in-vitro-Phagozytose von Fluorescein Herstellung Perlen und in-vivo Phagozytose von Pseudomonas Aeruginosa Green Fluorescent Protein. Wir beschreiben auch eine Methode für das clearing von p. Aeruginosa bei Mäusen.
Abstract
Alveoläre Makrophagen (AMs) bewachen den alveolären Raum der Lunge. Phagozytose durch AMs spielt eine entscheidende Rolle bei der Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger, die Entfernung von abgestorbenen Zellen oder Fremdkörper, und bei der Lösung von Entzündungsreaktionen und Umbau-Gewebe verarbeitet, die durch verschiedene Oberflächen-Rezeptoren vermittelt werden Das AMs. Hier berichten wir über Methoden zur Analyse der phagocytic Funktion des AMs mit in-vitro- und in-vivo-Tests und experimentelle Strategien um zu unterscheiden, die Muster-Anerkennung-Rezeptor – Komplement-Rezeptor- und Fc-Gamma-Rezeptor-vermittelten Phagozytose. Schließlich diskutieren wir eine Methode zu etablieren und zu charakterisieren ein p. Aeruginosa Lungenentzündung Modell bei Mäusen zu in-vivo bakterielle Abstand beurteilen. Diese Tests sind die am häufigsten verwendeten Methoden, AM Funktionen zu bewerten und können auch zur Funktion der Makrophagen und bakterielle Spiel in andere Organe zu studieren.
Introduction
AMs sind die wichtigsten Residenten Fresszellen in die Alveolen in der Ruhephase und einer der Hauptakteure der angeborenen Immunantwort durch die Anerkennung und Internalisierung der eingeatmete Krankheitserreger und Fremdkörper1,2. Es wurde berichtet, dass AMs unerlässlich für die schnelle Abfertigung von vielen pulmonale Krankheitserreger wie p. Aeruginosa und Klebsiella Pneumonie3,4, sind also ein Mangel an AM Phagozytose oft in die Atemwege führt Infektionen, wie z. B. akute Lungenentzündung, die höhere Mortalität und Morbidität führen.
AMs initiieren auch angeborene Entzündungsreaktionen in der Lunge durch die Herstellung Zytokine und Chemokine wie TNF-α und IL-1β, welche Übersprechen mit anderen Zellen der alveolären Umwelt produzieren Chemokine und entzündliche Neutrophilen, Monozyten, rekrutieren und Adaptive Immunzellen in der Lunge5. Zum Beispiel hilft IL-1β von AMs produziert die Freisetzung von Neutrophilen Chemokin CXCL8 aus Epithelzellen6Prime. Darüber hinaus tragen AMs zur Phagozytose des apoptotischen polymorphkernige Leukozyten (PMNs), was dazu führt, das nachhaltige Austreten von intrazellulären Enzyme von PMNs Nichtbeachtung umliegendes Gewebe, wodurch Gewebeschäden und längerer Entzündung 7 , 8 , 9.
Phagozytose durch das AMs wird durch eine direkte Anerkennung der Pathogen-assoziierte molekulare Muster auf der Oberfläche der Erreger durch die Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRRs) des AMs oder durch die Bindung von opsonized Krankheitserreger mit immun-Effektor-Rezeptoren des AMs vermittelt. 10. für Letzteres AMs erkennt die Ziele mit Immunglobulin (IgG) opsonized durch ihre Fcγ Rezeptoren (FcγR) oder die Erreger beschichtet mit Ergänzung Fragmente, C3b und C3bi, durch deren Komplement-Rezeptoren (CR)11. Unter Ergänzung Rezeptoren die CR die Immunglobulin-Superfamilie (CRIg) drückt sich selektiv im Gewebe Makrophagen12und den letzten Feststellung hob die Rolle der CRIg in AM Phagozytose im Zusammenhang mit p. Aeruginosa Lungenentzündung 13.
Viele Originalstudien verwenden Methoden, um Makrophagen Phagozytose um zu beschreiben, die molekularen Mechanismen der Makrophagen Funktion14,15zu bewerten. Methoden wie in-vivo Phagozytose erfordern jedoch eine präzise Quantifizierung der Phagozytose. Hier fassen wir eine detaillierte Methode für in-vitro- und in-vivo Phagozytose mit Fluorescein erfolgt (FITC)-Glas Perlen und p. Aeruginosa grün fluoreszierenden Proteins (GFP), beziehungsweise. Darüber hinaus erläutern wir die Methode der Unterscheidung zwischen PRR, CR und FcγR vermittelt Phagozytose. Zu guter Letzt berichten wir über eine Methode, um bakterielle Clearance bei Maus in Bezug auf p. Aeruginosa Lungenentzündung zu charakterisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während der Durchführung einer Gas-Austausch-Funktion, konfrontiert die Lunge anhaltend Fremdkörper, Krankheitserreger und Allergene. AMs bieten die erste Linie der Verteidigung aufgrund ihrer wichtigsten Funktion, nämlich Phagozytose. AMs auch mit anderen Immunzellen in der Krankheitserreger zu zerstören und die Auflösung der Entzündung zu koordinieren. Hier beschrieben wir Methoden zur Bewertung der speziell Phagozytose durch AMs isoliert von der Maus-Lunge. Das Protokoll präsentiert in diesem Manuskript erklä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird unterstützt durch Zuschuss R01HL116826 an X. Zhao.
Materials
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
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