Sonra Ultrastructural nöroplastisite parametrelerinde Utero iletim gelişmekte olan fare beyin ve omurilik değerlendirilmesi
Summary
Transmisyon elektron mikroskobu ve rahimde iletim sinir sisteminin iyi ultrastructure morfolojik değişiklikler geliştirme sırasında çalışmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu kombine yöntem değişiklikleri içine derin anlayışlar nöroplastisite ile ilgili topografik ifadelerinin temel yapısal detayları verir.
Abstract
Bu da çalışmanın ilgi bir protein tarafından etkilenen belirsizliğe yer bırakmadan tanımlanan topografik yapılarda ultrastructural parametrelerinin kesin morfometrik analizi nişan rahimde iletim transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile birleştirir Bu viral havalesi yoluyla organizma içine giriliyor. Bu kombine yaklaşım aşağıdaki topografik navigasyon haritaları bir doku atlasında tarafından ultrastructural kimlik macrostructural yumuşak bir geçiş sağlar. Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu içinde-utero-transduced doku ortaya neuropil ve plastisite parametreleri, cross-sectioned sinaptik bouton alanları, sinaptik veziküller ve mitokondri içinde sayısı gibi iyi ultrastructure bir Bouton profil, sinaptik kişiler, cross-sectioned aksonal alanları, miyelin kılıf kalınlığı, miyelin lamellae sayısı ve mitokondri profilleri cross-sectioned alanları uzunluğu. Bu parametreler analizi genetik yapı viral havalesi ile etkilenen sinir sistemi alanlarında ultrastructural plastisite değişiklikleri içine temel görüşler ortaya koymaktadır. Bu kombine yöntem yalnızca nöronal plastisite üzerinde genetiği biomolecules ve/veya uyuşturucu etkisi doğrudan çalışmak için kullanılamaz ancak da (örneğin, bağlamında nöronal plastisite rahimde Kurtarma çalışma imkanı açılır nörodejeneratif hastalıklar).
Introduction
Yok foton bir elektron derinlik sınıfta bir ultrathin doku numune nüfuz. Bu çok değerli avantajları TEM için nanometre çözünürlük fotoğraf güzel ışık mikroskobu teknikleri için karşılaştırıldığında yapıları yakalama öznitelikleri. Örneğin, mitokondri, melanosomes ve çeşitli salgı granülleri, mikrotübüller, microfilaments, kirpikler, microvilli ve hücreler arası kavşak (hücre yüzey gibi hücre içi organellerin görselleştirme için TEM sağlar uzmanlık), özellikle sinir sistemi1,2,3,4‘ te synapses. Metodolojik da çalışmanın genel amacı nöral plastisite değişimler ultrastructural tanıma geliştirme doğum öncesi girişim üzerine rahimde iletim ve TEM state-of–art teknikleri birleştirerek bulunuyor. İlgi virally kodlanmış proteinler rahimde omurilik6dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi5,6,7, transduced. Örneğin, rahimde iletim TEM ile birlikte hücre adezyon molekülü L1 etkisi motorlu plastisite L1-eksik farelerde özellikle L1 ve nükleer reseptör proteinler arasında etkileşimi ile ilgili öğrenme eğitimi için kullanılmıştır serebellar nöronlar7‘ de.
Nöroplastisite parametreler analiz sinir sistemi içinde en küçük alanlarda lokalizasyonu hakkında kesin bilgi gerektirir. Bu nedenle, ultrastructural detayları ve diğer yapıları ile ilgili tam topografik yönelimleri açıklamak yeterli olduğunu. Bu da çalışmanın, hem ışık hem elektron mikroskobu bağlı farklı morfolojik bölgelerin detaylı incelenmesi yönelik belirli bir hazırlık yöntemi gösterilir. Bu yaklaşım doku manipülasyonu, fare beyin ve omurilik rahimde iletim ile başlayan ve perfüzyon fiksasyon tarafından takip çeşitli teknikleri birleştiren kalıp gömme ve doku TEM için işleme. Kesin microphotographic ve düşük-büyütme belgelenmesi için sağlar girişim ışık yansıması tekniği kullanarak doku belgelerine gömme ve TEM için doku işleme arasında dahil önemli bir adım olduğunu doku örnekleri8,9,10. Mevcut yaklaşım dahil, bu teknik araştırmacılar topoğrafik ve yapısal detaylar sinir doku yüzeyler ve numune dilim profilleri onların hazırlık TEM için önce incelemek için sağlar.
Bütün beyin kesit için özel bir çerçeve stereotaksik koordinatlarına karşılık gelir. Bu çerçeve morfolojik üç boyutlu (3D) yeniden inşası sinir doku alanlarda faydaları ve xarakteristikaları analizi için kullanılabilir. Macrographs görüntülenmeyecektir bölümlerin topografik koordinatları atanır ve seri olarak numaralı kesitler doku atlas haritaları oluşturmak.
İşleme reçine sonra katıştırılmış doku ultrathin bölümlere kesitli (< 70 nm) yukarıda belirtilen doku atlas haritaları göre Seçili alanlar içeren. Ultrathin bölümleri TEM içeriklerini ve komşu yapılar kompleksi içinde ilgili kişilere plastisite parametreleri (örneğin, kesit profil alanları sinaptik boutons veya aksonal lifleri) yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için tabi neuropil.
Burada açıklanan yöntemi ile mikro – ve taşınımı için yumuşak bir geçiş görüntülenmeyecektir macrostructures üzerinden morfolojik nöronal plastisite karşılaştırmalı ayrıntılı çalışmalar geliştirme rahim içinde iletim sonra gergin verir sistem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çok önemli bir adım rahimde iletim / enjeksiyon işlemdir. Hassas Enjeksiyon beyin ventrikül veya ilgi başka bir alan içine deneyim ve uygulamalı beceri gerektirir. Daha ince microcapillary uç, daha az doku hasarı oluşabilir; Ancak, bu enjeksiyon basıncı arttırmak pahasına. Rahimde elektroporasyon19,20,21,22aksine, enjekte embriyo rahimde iletim sonra hayatta kalma oranı çok yü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar meslektaşları hayvan tesisi Tıp Fakültesi, Bochum Ruhr Üniversitesi, onların desteği ve hayvan bakımı için teşekkür ederiz.
Materials
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | – | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | – | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M., Hayat, M. A. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
