Оценки параметров ультраструктурных нейропластичности после в утробе матери трансдукции развивающихся мыши головного и спинного мозга
Summary
Сочетание просвечивающей электронной микроскопии и внутриутробно трансдукции представляет собой мощный подход для изучения морфологических изменений в тонкой Ультраструктура нервной системы во время разработки. Этот комбинированный метод позволяет глубокое понимание изменений в структурные детали лежащие в основе нейропластичности отношении их топографические представительства.
Abstract
Настоящее исследование объединяет внутриутробно трансдукция с просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) направленных на точное морфометрических анализ ультраструктурных параметров однозначно определены топографических структур, пострадавших от протеин интереса что вводится в организм через вирусный передачи. Этот комбинированный подход позволяет для плавного перехода от макроструктурных ультраструктурных идентификации следующих топографических навигационных карт в атласе ткани. Высоким разрешением электронной микроскопии в utero преобразованы ткани раскрывает прекрасные Ультраструктура Нейропиль и его пластичности параметров, таких как районы поперечном синаптических бутона, количество синаптических пузырьков и митохондрий в течение Бутон профиль, длину синаптических контактов, поперечном аксональное районов, толщина миелиновой оболочки, количество ламели миелина и поперечном областях митохондрий профилей. Анализ этих параметров показывает основные понимание изменений ультраструктурных пластичности в районах нервной системы, которые страдают от вирусных передачи генетической конструкции. Этот комбинированный метод может использоваться не только для изучения прямое воздействие генетически биомолекул или наркотики на пластичность нейронов, но также открывает возможность для изучения в утробе спасения пластичности нейрональных (например, в контексте нейродегенеративные заболевания).
Introduction
Не фотон может проникать ультратонких ткани образца в глубине класса электрона. Это атрибуты бесценный преимущества ТЕА в захват нанометра резолюции изображений тонких структур по сравнению с методами световой микроскопии. К примеру ТЕА позволяет для визуализации внутриклеточных органелл например митохондрий, меланосомы и различные виды секреторных гранул, микротрубочки, микрофиламенты, реснички, микроворсинки и межклеточные соединения (клеточной поверхности специализации), в частности синапсов в нервной системы,12,3,4. Общая цель настоящего методологические исследования признается ультраструктурные изменения пластичности нейронных во время разработки после пренатальной вмешательства путем объединения последнему слову техники внутриутробно трансдукция и ТЕА. Вирусно закодированные протеинов интереса были преобразованы в утробе матери в центральной нервной системе5,6,7, включая спинного6. Например в утробе трансдукции в сочетании с ТЕА был использован для изучения воздействия молекулы адгезии клеток L1 на Мотор обучения пластичности в L1-недостаточным мышей, в частности в том, что касается взаимосвязи между L1 и ядерных рецепторов белки в7нейронов мозжечка.
Анализ параметров нейропластичности требует точной информации о локализации маленьких областей внутри нервной системы. Таким образом это достаточно для описания ультраструктурных деталей и их точные топографические ориентации в отношении других структур. В настоящем исследовании представлен конкретные подготовительные метод, направленный на подробное расследование различных морфологических областей на основе света и электронной микроскопии. Этот подход сочетает в себе несколько методов манипуляции ткани, начиная с внутриутробно трансдукции мыши головного и спинного мозга и следуют перфузии фиксации, встраивание плесень и обработка ткани для ТЕА. Важным шагом, включенных между внедрением и обработки ткани для ТЕА является документация ткани, используя метод отражения света вмешательства, который позволяет для точного microphotographic и низким увеличение документации ткани образцов8,9,10. Включены в нынешний подход, эта техника позволяет исследователям изучить топографические и структурные детали нервной ткани поверхностей и профилей фрагмент образца до их подготовки к ТЕА.
Особый кадр для разрезания весь мозг соответствует стереотаксического координат. Эта рамка выгоды морфологических трехмерные (3D) реконструкции районов в нервной ткани и может быть использован для анализа морфометрических. Macrographs визуализация Секции назначаются топографических координат, и последовательно пронумерованными разделами построения карт в атласе ткани.
После обработки смолы, встроенных ткани секционного ультратонких разделов (< 70 нм) содержащий отдельных областях, согласно карты выше ткани атласа. Ультратонких секций подвергаются ТЕА для получения изображения с высоким разрешением пластичности параметров (например, сечение профиля области синаптической boutons или аксональное волокон), их содержание и контактов в соседние структуры внутри комплекса Нейропиль.
С методом, описанным в настоящем документе плавный переход от визуализированных макростроение микро – и наноструктур позволяет сравнительных углубленные исследования морфологическая пластичность нейронов после в утробе матери трансдукции развивающихся нервной системы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Решающий шаг в утробе трансдукции является процедура инъекции. Точное инъекции в желудочки мозга или в другую область интересов требует опыта и практических навыков. Чем тоньше кончик микрокапиллярной, может произойти меньше повреждение тканей; Однако это за счет увеличения давления …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят коллег животных фонда на медицинском факультете, Рурского университета Бохума, за их поддержку и животных ухода.
Materials
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | – | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | – | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M., Hayat, M. A. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
