Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale
Summary
La combinazione di microscopia elettronica di trasmissione e trasduzione nell’utero è un approccio potente per studiare i cambiamenti morfologici nell’ultrastruttura bene del sistema nervoso durante lo sviluppo. Questo metodo combinato consente approfondimenti cambiamenti nei dettagli strutturali sottostanti la neuroplasticità rispetto alla loro rappresentazione topografica.
Abstract
Il presente studio combina trasduzione nell’utero, con microscopia elettronica a trasmissione (TEM), che mira ad un’analisi morfometrica precisa dei parametri ultrastrutturali in strutture topografiche inequivocabilmente identificati, colpite da una proteina di interesse che è introdotta nell’organismo tramite trasferimento virale. Questo approccio combinato consente una transizione fluida dal macrostrutturali identificazione ultrastrutturale di seguenti mappe topografiche in un Atlante di tessuto. Microscopia elettronica ad alta risoluzione del tessuto in-utero-trasdotte rivela l’ultrastruttura bene del neuropil e i relativi parametri di plasticità, quali le bouton sinaptico zone, il numero delle vescicole sinaptiche e dei mitocondri all’interno di un Profilo di bouton, la lunghezza dei contatti sinaptici, le aree di axonal, lo spessore di foderi di myelin, il numero delle lamelle di mielina e le zone di profili di mitocondri. L’analisi di questi parametri rivela intuizioni essenziali modifiche ultrastrutturali plasticità nelle aree del sistema nervoso che sono interessati dal trasferimento virale del costrutto genetico. Questo metodo combinato non può essere utilizzato solo per studiare l’effetto diretto di geneticamente biomolecole e/o droghe sulla plasticità neuronale, ma apre anche la possibilità di studiare il salvataggio nell’utero della plasticità neuronale (ad es., nel contesto della malattie neurodegenerative).
Introduction
Nessun fotone può penetrare un campione di tessuto ultrasottile del grado di profondità di un elettrone. Questo attribuisce vantaggi inestimabili a TEM a catturare immagini a risoluzione nanometrica di strutture fini rispetto alle tecniche di microscopia chiara. Ad esempio, TEM consente la visualizzazione di organelli intracellulari come i mitocondri, i melanosomes e vari tipi di granuli secretori, microtubuli, microfilamenti, ciglia, microvilli e giunzioni intercellulari (superficie cellulare specializzazioni), in particolare le sinapsi nel sistema nervoso1,2,3,4. L’obiettivo generale del presente studio metodologico è il riconoscimento ultrastrutturale dei cambiamenti nella plasticità neurale durante lo sviluppo su interferenza prenatale combinando le tecniche di state-of-the-art di trasduzione nell’utero e TEM. Viralmente codificato le proteine di interesse sono state trasdotte nell’utero nel sistema nervoso centrale5,6,7, compreso il midollo spinale6. Per esempio, nell’utero trasduzione in combinazione con TEM è stato utilizzato per studiare l’effetto della molecola di adesione cellulare L1 sull’apprendimento plasticità nei topi L1-carenti, in particolare per quanto riguarda l’interazione tra L1 e proteine recettori nucleari motorio in neuroni cerebellari7.
L’analisi dei parametri di neuroplasticità richiede informazioni precise circa la localizzazione delle zone più piccole all’interno del sistema nervoso. Pertanto, essa è sufficiente descrivere dettagli ultrastrutturali e il loro orientamento topografico esatta rispetto alle altre strutture. Nello studio presente, è presentato un metodo specifico preparatorio puntando l’indagine dettagliata di aree morfologiche distinte sulla base sia di luce e di microscopia elettronica. Questo approccio combina diverse tecniche di manipolazione dei tessuti, a partire con trasduzione nell’utero del cervello del topo e del midollo spinale e seguita dalla fissazione di aspersione, incorporamento di muffa e il tessuto di elaborazione per TEM. Un passo essenziale incluso tra l’incorporamento e la lavorazione del tessuto per TEM è la documentazione del tessuto, usando la tecnica di riflessione della luce di interferenza che permette la precisa documentazione microfotografici e basso ingrandimento dei tessuto esemplari8,9,10. Inglobato l’approccio attuale, questa tecnica permette ai ricercatori di esaminare dettagli topografici e strutturali delle superfici di tessuto nervoso e dei profili di fetta di campione prima della loro preparazione per TEM.
Una cornice speciale per il sezionamento intero cervello corrisponde alle coordinate stereotassiche. Questo telaio avvantaggia la ricostruzione (3D) tridimensionale morfologica delle aree nel tessuto nervoso e può essere utilizzato per l’analisi morfometrica. Le grafie delle sezioni visualizzate vengono assegnate coordinate topografiche e le sezioni numerate progressivamente costruire mappe in un Atlante di tessuto.
Dopo resina l’elaborazione, il tessuto incorporato è sezionato in sezioni ultrasottili (< 70 nm) contenenti aree selezionate, secondo le mappe dell'Atlante del tessuto di cui sopra. Le sezioni ultrasottili sono sottoposti a TEM per ottenere immagini ad alta risoluzione di parametri di plasticità (ad es., sezione profilo aree di boutons sinaptici o fibre assonali) del loro contenuto e dei contatti per le strutture vicine all'interno del complesso neuropil.
Con il metodo descritto nel presente documento, la transizione da macrostrutture visualizzati per micro – e nanostrutture consente studi comparativi approfonditi di plasticità neuronale morfologici dopo nell’utero trasduzione dello sviluppo nervoso sistema.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un passo cruciale di trasduzione nell’utero è la procedura di iniezione. L’iniezione precisa nei ventricoli del cervello o in un’altra area di interesse richiede esperienza e abilità pratiche. Più sottile è la punta di microcapillary, può verificarsi il meno danno tessutale; Tuttavia, questo è a costo di aumentare la pressione di iniezione. In contrasto con elettroporazione nell’utero19,20,21,2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano i colleghi della struttura animale alla facoltà di medicina, Università della Ruhr di Bochum, per la loro cura di animali e di supporto.
Materials
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | – | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | – | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
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