Bewertung der Ultrastrukturforschung Neuroplastizität Parameter nach In Utero Transduktion von Entwicklungsländern Mausgehirn und Rückenmark
Summary
Die Kombination von Transmissions-Elektronenmikroskopie und in der Gebärmutter Transduktion ist ein leistungsfähiger Ansatz für das Studium der morphologischer Veränderungen in den feinen Ultrastruktur des Nervensystems während der Entwicklung. Diese kombinierte Methode ermöglicht tiefe Einblicke in Änderungen in Strukturdetails Neuroplastizität in Bezug auf ihre topographische Darstellung zugrunde liegen.
Abstract
Die vorliegende Studie verbindet im Mutterleib Transduktion mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) mit dem Ziel einer präzise morphometrischen Analysis der Ultrastrukturforschung Parameter eindeutig identifizierten topographische Strukturen, ein Protein des Interesses betroffen Das wird in den Organismus über virale Übertragung eingeführt. Dieser kombinierte Ansatz ermöglicht einen reibungslosen Übergang vom Macrostructural zum Ultrastrukturforschung Identifikation durch folgende topographische Navigationskarten in einem Gewebe-Atlas. Hochauflösende Elektronenmikroskopie des Gewebes in-Utero-ausgestrahlt verrät das feine Ultrastruktur der Neuropil und dessen Plastizität Parameter, wie z. B. Modellbaugruppe synaptische Bouton Bereiche, die Anzahl der synaptischen Vesikel und Mitochondrien innerhalb einer Bouton Profil, die Länge der synaptischen Kontakte, geschnittenen axonale Bereiche, die Dicke der Myelinscheiden, die Anzahl der Myelin-Lamellen und geschnittenen Flächen der Mitochondrien Profile. Die Analyse dieser Parameter zeigt wesentliche Einblicke in die Veränderungen der Ultrastrukturforschung Plastizität in den Bereichen des Nervensystems, die durch die viralen Übertragung von genetischen Konstrukt betroffen sind. Diese kombinierte Methode kann nicht nur zur Untersuchung der direkten Wirkung von gentechnisch Biomoleküle und/oder Drogen auf neuronale Plastizität, sondern eröffnet auch die Möglichkeit, die im Mutterleib Rettung neuronale Plastizität (z. B. im Rahmen der Studie Neurodegenerative Erkrankungen).
Introduction
Kein Photon kann eine ultradünne Gewebeprobe in die Tiefe Note eines Elektrons eindringen. TEM schreibt das unschätzbare Vorteile bei der Erfassung von Nanometer Auflösung feiner Strukturen im Vergleich zu lichtmikroskopische Techniken. Beispielsweise kann TEM für die Visualisierung von intrazellulären Organellen wie Mitochondrien, Melanosomen und verschiedene Arten von sekretorischen Granulat, Mikrotubuli, Microfili, Cilien, Mikrovilli und interzellulären Verzweigungen (Zelloberfläche Spezialisierungen), insbesondere die Synapsen im Nervensystem1,2,3,4. Das übergeordnete Ziel der vorliegenden Studie methodische ist die Ultrastrukturforschung Anerkennung der Änderungen in neuronale Plastizität während der Entwicklung auf pränatale Störungen durch die Kombination der State-of-the-Art-Techniken in der Gebärmutter Transduktion und TEM. Viral kodierten Proteine des Interesses haben in der Gebärmutter in das zentrale Nervensystem5,6,7, einschließlich Rückenmark6ausgestrahlt wurde. Zum Beispiel wurde in der Gebärmutter Transduktion in Kombination mit TEM verwendet für die Untersuchung der Wirkung von der Zelle Adhäsionsmolekül L1 auf motorischen Lernens Plastizität bei L1-defizienten Mäusen, insbesondere im Hinblick auf das Zusammenspiel zwischen L1 und nukleare Rezeptorproteine zerebelläre Neuronen7.
Die Analyse der Neuroplastizität Parameter erfordert genaue Informationen über die Lokalisation der kleinste Bereiche innerhalb des Nervensystems. Daher ist es angemessen, Ultrastrukturforschung Details und die genaue topographische Orientierung in Bezug auf andere Strukturen zu beschreiben. In der vorliegenden Studie wird eine bestimmte vorbereitende Methode mit dem Ziel der detaillierten Untersuchung von unterschiedlichen morphologischen Bereichen basierend auf Licht- und Elektronenmikroskopie vorgestellt. Dieser Ansatz kombiniert mehrere Techniken der Gewebe Manipulation, beginnend mit der Mausgehirn und Rückenmark im Mutterleib Transduktion und gefolgt von Perfusion Fixierung, Schimmel-einbetten und die Verarbeitung des Gewebes für TEM. Ein wesentlicher Schritt zwischen die Einbettung und die Verarbeitung des Gewebes für TEM ist die Dokumentation des Gewebes, mit Hilfe der Interferenz Lichtreflexion Technik, die für die präzise lichtmikroskopischen und niedrig-Vergrößerung Dokumentation erlaubt Gewebe Proben8,9,10. Das derzeitige Konzept integriert, ermöglicht diese Technik Forscher um topografische und strukturelle Details von Nervengewebe Oberflächen und der Probe Slice Profile vor ihrer Zubereitung für TEM zu untersuchen.
Ein spezieller Rahmen für die ganze Gehirne-Schnitt entspricht stereotaktischen Koordinaten. Dieser Rahmen profitiert die morphologische dreidimensionale (3D) Rekonstruktion der Bereiche im Nervengewebe und morphometrische Analyse einsetzbar. Die Aufnahmen der visualisierten Abschnitte topographische Koordinaten zugewiesen sind, und die seriell nummerierte Abschnitte bauen Karten in einem Gewebe-Atlas.
Nach Harz verarbeitet, wird das eingebettete Gewebe in ultradünnen Abschnitte geschnitten (< 70 nm) mit ausgewählten Bereichen nach den Karten des Atlas genannten Gewebe. Die ultradünnen Abschnitte unterliegen TEM, hochauflösende Bilder der Plastizität Parameter (z. B. Querschnitt Profilbereiche der synaptischen Boutons oder axonalen Fasern) ihres Inhalts und der Kontakte zu benachbarten Strukturen innerhalb des Komplexes zu erhalten Neuropil.
Mit der hier beschriebenen Methode ermöglicht der reibungslose Übergang vom visualisierten Performance, Mikro- und Nanostrukturen detaillierte Vergleichsstudien der morphologischen neuronale Plastizität nach in Utero Transduktion des sich entwickelnden nervös System.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein entscheidender Schritt in der Gebärmutter Transduktion ist das Injektionsverfahren. Die präzise Injektion in die Hirnkammern oder in einen anderen Bereich des Interesses erfordert Erfahrung und praktische Fähigkeiten. Je dünner der Microcapillary Spitze, kann weniger Gewebeschäden auftreten; Dies ist jedoch auf Kosten der Einspritzdruck erhöht. Im Gegensatz zu den in der Gebärmutter Elektroporation19,20,21,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken die Kollegen aus der Tierhaltung an der medizinischen Fakultät, Ruhr-Universität Bochum, für ihre Unterstützung und Tier Pflege.
Materials
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | – | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | – | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
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