Beoordeling van ultrastructurele Neuroplasticiteit Parameters na In Utero transductie van de ontwikkelingslanden muis hersenen en ruggenmerg
Summary
De combinatie van transmissie-elektronenmicroscopie en in de baarmoeder transductie is een krachtige aanpak voor het bestuderen van morfologische veranderingen in de fijne ultrastructuur van het zenuwstelsel in ontwikkeling. Deze gecombineerde methode kunt diep inzicht in veranderingen in structurele bijzonderheden Neuroplasticiteit met betrekking tot hun topografische vertegenwoordiging.
Abstract
De huidige studie combineert in de baarmoeder transductie met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) die gericht zijn op een analyse van de precieze morphometrical van ultrastructurele parameters in ondubbelzinnig geïdentificeerde topografische structuren beïnvloed door een proteïne van belang dat is geïntroduceerd in het organisme via virale overdracht. Deze gecombineerde aanpak zorgt voor een soepele overgang van macrostructural naar ultrastructurele identificatie door volgende topografische navigatie kaarten in een atlas van weefsel. Hoge resolutie elektronenmicroscopie van de in-utero-getransduceerde weefsel onthult de fijne ultrastructuur van de neuropil en bijbehorende plasticiteit-parameters, zoals cross-sectioned synaptic bouton gebieden, het aantal synaptische vesikels- en mitochondriën binnen een Bouton profiel, de lengte van de synaptische contacten, cross-sectioned axonale gebieden, de dikte van myeline omhulsels, het aantal myeline lamellen en cross-sectioned gebieden van mitochondriën profielen. De analyse van deze parameters blijkt essentieel inzicht in veranderingen van ultrastructurele plasticiteit in de gebieden van het zenuwstelsel die worden beïnvloed door de virale overdracht voor de genetische construct. Deze gecombineerde methode kan niet alleen worden gebruikt voor het bestuderen van het directe effect van genetisch gemanipuleerde biomoleculen en/of drugs op de neuronale plasticiteit maar opent ook de mogelijkheid te bestuderen van de in de baarmoeder redding van neuronale plasticiteit (bijvoorbeeld in het kader van neurodegeneratieve ziekten).
Introduction
Geen foton kan doordringen het specimen van een uiterst dun weefsel in de rang van de diepte van een elektron. Dit schrijft de onschatbare voordelen aan TEM in het vastleggen van nanometer resolutiebeelden van fijne structuren in vergelijking met de lichte microscopie technieken. Bijvoorbeeld, zorgt TEM voor de visualisatie van intracellulaire organellen, zoals mitochondriën, melanosomes en verschillende soorten secretoire korrels, microtubuli Microfilamenten, cilia, microvilli en intercellulaire kruispunten (celoppervlak specialisaties), in het bijzonder synapses in het zenuwstelsel1,2,3,4. Het algemene doel van de huidige methodologische studie is de ultrastructurele erkenning van veranderingen in de Neurale plasticiteit tijdens ontwikkeling bij prenatale inmenging door het combineren van de state-of-the-art-technieken in de baarmoeder transductie en TEM. Viraal gecodeerde proteïnen van belang hebben al getransduceerde in de baarmoeder in het centrale zenuwstelsel5,6,7, met inbegrip van het ruggenmerg6. Bijvoorbeeld, is in de baarmoeder signaaltransductie in combinatie met TEM gebruikt voor het bestuderen van het effect van de cel adhesie molecuul L1 op motorisch leren plasticiteit in L1-deficiënte muizen, in het bijzonder met betrekking tot de wisselwerking tussen L1 en nucleaire receptor eiwitten in cerebellaire neuronen7.
De analyse van neuroplasticiteit parameters vereist nauwkeurige informatie over de lokalisatie van de kleinste gebieden binnen het zenuwstelsel. Daarom is het voldoende om ultrastructurele details en hun exacte topografische oriëntatie ten opzichte van andere structuren te beschrijven. In de huidige studie, wordt een specifieke voorbereidende methode die gericht zijn op het gedetailleerde onderzoek van verschillende morfologische gebieden op basis van zowel licht- en elektronenmicroscopie gepresenteerd. Deze aanpak combineert verschillende technieken van weefsel manipulatie, beginnend met in de baarmoeder transductie van muis hersenen en het ruggemerg en gevolgd door perfusie fixatie, schimmel-insluiting en verwerking van het weefsel voor TEM. Een essentiële stap opgenomen tussen het insluiten en de verwerking van het weefsel voor TEM is de documentatie van het weefsel, met behulp van de interferentie licht reflectie techniek dat voorziet in de nauwkeurige microphotographic en laag-vergroting documentatie van weefsel monsters8,9,10. Deze techniek is opgenomen in de huidige aanpak, kan onderzoekers te onderzoeken van de topografische en structurele details van zenuwweefsel oppervlakken en specimen segment profielen voorafgaand aan hun voorbereiding voor TEM.
Een speciaal frame voor afdelen hele hersenen komt overeen met stereotaxic coördinaten. Dit frame profiteert van de morfologische driedimensionale (3D) wederopbouw van gebieden in zenuwweefsel en kan worden gebruikt voor Morfometrische analyse. De macrographs van de gevisualiseerde secties topografische coördinaten worden toegewezen, en de serieel genummerde secties bouwen kaarten in een atlas van weefsel.
Na hars verwerking, het ingesloten weefsel is gesegmenteerd in uiterst dunne secties (< 70 nm) met geselecteerde gebieden, volgens de kaarten van de bovengenoemde weefsel atlas. De uiterst dunne secties zijn onderworpen aan TEM resolutieafbeeldingen van plasticiteit parameters (bijvoorbeeld doorsnede profiel gebieden van synaptic los of axonale vezels) verkrijgen van hun inhoud en contacten aan naburige structuren binnen het complex neuropil.
Met de hierin beschreven methode toelaat de soepele overgang van de gevisualiseerde macrostructures naar micro- en nanostructuren vergelijkende diepgaande studies van morfologische neuronale plasticiteit na in utero transductie van de ontwikkelingslanden nerveus systeem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een cruciale stap van in de baarmoeder transductie is de injectie-procedure. De nauwkeurige injectie in de ventrikels van de hersenen of in een ander gebied van belang vereist ervaring en praktische vaardigheden. Hoe dunner het uiteinde van de microcapillary, de minder weefselbeschadiging kan optreden; Dit is echter ten koste van de toenemende druk van de injectie. In tegenstelling tot in de baarmoeder electroporation19,20,21<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken de collega’s van het dier faciliteit aan de medische faculteit, Ruhr-Universität Bochum, voor hun steun en dier zorg.
Materials
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | – | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | – | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M., Hayat, M. A. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
