تقييم البارامترات أعصاب Ultrastructural بعد في توصيل الرحم النامي الماوس المخ والحبل الشوكي
Summary
المزيج من مجهر إلكتروني وتوصيل في الرحم ونهج قوية لدراسة التغييرات الشكلية في أولتراستروكتوري جيد للجهاز العصبي أثناء التطوير. يسمح هذا الأسلوب الجمع بين الأفكار العميقة إلى تغييرات في التفاصيل الهيكلية الكامنة وراء أعصاب فيما يتعلق بتمثيلها الطوبوغرافية.
Abstract
هذه الدراسة يجمع بين توصيل في الرحم مجهر إلكتروني (TEM) تهدف إلى إجراء تحليل دقيق مورفوميتريكال المعلمات ultrastructural في هياكل الطوبوغرافية التي تم تحديدها على نحو لا لبس فيه، المتأثرين بروتين للفائدة أن يتم إدخال في الكائن الحي عن طريق نقل الفيروس. يسمح هذا النهج الموحد لانتقال سلس من ماكروستروكتورال لتحديد هوية ultrastructural بالتالي خرائط الملاحة الطوبوغرافية في أطلس أنسجة. يكشف المجهر الإلكتروني عالية الاستبانة للأنسجة في-الرحم-ترانسدوسيد أولتراستروكتوري غرامة نيوروبيل ومعلماتها اللدونة، مثل المناطق كروسسيكتيونيد بوتون متشابك، والعدد من الحويصلات متشابك والميتوكوندريا داخل بوتون الشخصية، طول اتصالات متشابك، ومناطق محواري كروسسيكتيونيد، سمك اﻷغماد المايلين، وعدد lamellae المايلين، ومناطق كروسسيكتيونيد الميتوكوندريا التشكيلات الجانبية. ويكشف تحليل هذه المعلمات الأساسية ثاقبة التغييرات من اللدونة ultrastructural في مجالات النظام العصبي التي تتأثر بنقل بنية الوراثية الفيروسية. هذا الأسلوب مجتمعة لا يمكن أن تستخدم فقط لدراسة التأثير المباشر للمهندسة وراثيا من الجزيئات الحيوية و/أو المخدرات على اللدونة العصبية ولكن أيضا يفتح إمكانية دراسة عملية الإنقاذ في الرحم من اللدونة العصبية (مثلاً، في سياق أمراض الأعصاب).
Introduction
يمكن اختراق لا فوتون عينة أنسجة سامسونج في درجة عمق إلكترون. وهذا سمات مزايا لا تقدر بثمن إلى تيم في التقاط الصور القرار نانومتر من الهياكل الدقيقة عند مقارنة بتقنيات الفحص المجهري الخفيفة. على سبيل المثال، يسمح تيم لتصور العضيات داخل الخلية مثل الميتوكوندريا والأجسام الصباغية، وأنواع مختلفة من حبيبات افرازية، ميكروتوبوليس، ميكروفيلامينتس، أهداب، زغيبات، والوصلات بين الخلايا (سطح الخلية التخصصات)، وبخاصة سينابسيس في الجهاز العصبي1،2،،من34. والهدف العام لهذه الدراسة المنهجية هو ultrastructural الاعتراف بالتغيرات في اللدونة العصبية أثناء التطوير على التدخل قبل الولادة عن طريق الجمع بين الدولة من أحدث تقنيات توصيل في الرحم وال. تم ترانسدوسيد البروتينات المرمزة فيروسي للفائدة في الرحم إلى أن الجهاز العصبي المركزي5،،من67، بما في ذلك الحبل الشوكي6. على سبيل المثال، توصيل في الرحم في تركيبة مع تيم قد استخدمت لدراسة تأثير جزيء التصاق الخلايا L1 على موتور التعلم اللدونة في الفئران تفتقر إلى المستوى 1، لا سيما فيما يتعلق بالتفاعل بين L1 والبروتينات مستقبلات النووية في7من الخلايا العصبية في الدماغ.
ويتطلب تحليل معلمات أعصاب معلومات دقيقة حول التعريب أصغر المناطق داخل الجهاز العصبي. ولذلك، فمن الملائم لوصف تفاصيل ultrastructural وميولهم الطوبوغرافية الدقيقة فيما يتعلق بالهياكل الأخرى. ويرد في هذه الدراسة، أسلوب تحضيرية محددة تهدف إلى تحقيق مفصل لمجالات المورفولوجية متميزة على أساس كل من الضوء والمجهر الإلكتروني. يجمع هذا النهج بين عدة تقنيات للتلاعب الأنسجة، بدءاً في الرحم وتوصيل الماوس المخ والحبل الشوكي، وتليها نضح التثبيت، تضمين العفن، وتجهيز الأنسجة لل. هو خطوة أساسية شملت بين التضمين وتجهيز الأنسجة لل الوثائق المتعلقة الأنسجة، واستخدام تقنية انعكاس الضوء التدخل الذي يسمح للوثائق ميكروفوتوجرافيك وتضخم منخفضة الدقة من الأنسجة العينات8،،من910. إدماج النهج الحالي، يتيح هذا الأسلوب الباحثين لدراسة التفاصيل الطوبوغرافية والهيكلية للسطوح النسيج العصبي والتشكيلات الجانبية لشريحة العينة قبل إعدادها لل.
إطار خاص لتقطيع العقول كله يناظر الإحداثيات ستيريوتاكسيك. فوائد تعمير المناطق في النسيج العصبي (3D) ثلاثي الأبعاد المورفولوجية هذا الإطار ويمكن أن تستخدم لتحليل شكلي. ماكروجرافس المقاطع تصور يتم تعيين الإحداثيات الطبوغرافية، وبناء الأقسام مرقمة تسلسلياً الخرائط في أطلس أنسجة.
بعد راتنج التجهيز، هو مقطوع الأنسجة المضمنة إلى أقسام سامسونج (< 70 نانومتر) التي تحتوي على مناطق مختارة، وفقا لخرائط الأطلس الأنسجة المذكورة أعلاه. المقاطع سامسونج يتعرضون لل للحصول على صور عالية الاستبانة للمعلمات اللدونة (مثلاً، عينة الشخصية المناطق boutons متشابك أو ألياف محواري) من محتوياتها واتصالاتها لهياكل المجاورة داخل المجمع نيوروبيل.
بالطريقة المبينة في هذا التقرير، يسمح الانتقال السلس من ماكروستروكتوريس تصور للمشاريع المتناهية الصغر والنانو دراسات متعمقة مقارنة اللدونة العصبية المورفولوجية بعد في الرحم توصيل النامية العصبي النظام.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوة حاسمة لتوصيل في الرحم هو إجراء الحقن. يتطلب حقن دقيقة في البطينين الدماغ أو في مجال آخر ذي أهمية الخبرة والتدريب العملي على المهارات. أرق تلميح ميكروكابيلاري، قد يحدث الضرر الأنسجة أقل؛ ومع ذلك، وهذا على حساب زيادة ضغط الحقن. على النقيض من انهانسر في الرحم19،<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الزملاء مرفق الحيوان في “كلية الطب”، جامعة روهر بوخوم، تقديم الرعاية لهم الدعم والحيوان.
Materials
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | – | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | – | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
References
- Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159 (1961).
- Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The Fine Structure of the Nervous System. , (1991).
- Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
- Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
- Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
- Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
- Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139 (1974).
- Andres, K. H., von Düring, M., Hayat, M. A. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. , 246-261 (1997).
- Andres, K. H., von Düring, M., Heym, C., Forssmann, W. -. G. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. , 100-108 (1981).
- Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
- Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
- Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169 (1967).
- Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
- Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
- Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
- Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84 (2014).
- Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48 (2017).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , 120-125 (2009).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
- Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
- Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).
