Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas
Summary
Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.
Abstract
La modificación posttranslacional de las proteínas por la pequeña proteína ubiquitina está involucrada en muchos eventos celulares. Después de la digestión tripptica de proteínas ubiquitinadas, se pueden utilizar péptidos con un remanente diglycine conjugado con el grupo de aminoácidos de épsilon (‘K-o-diglycine’ o simplemente ‘diGly’) para rastrear el sitio de modificación original. La inmunopurificación eficiente de péptidos diGly combinados con la detección sensible por espectrometría de masas ha dado lugar a un enorme aumento en el número de sitios de ubiquitinación identificados hasta la fecha. Hemos realizado varias mejoras en este flujo de trabajo, incluyendo el fraccionamiento de fase inversa de pH alto fuera de línea de péptidos antes del procedimiento de enriquecimiento, y la inclusión de ajustes de fragmentación de péptidos más avanzados en el multipolo de enrutamiento iónico. Además, una limpieza más eficiente de la muestra utilizando un tapón basado en filtros para retener las perlas de anticuerpos da como resultado una mayor especificidad para los péptidos diglily. Estas mejoras resultan en la detección rutinaria de más de 23.000 péptidos diGly de células de cáncer de cuello uterino humano (HeLa) las células se lisia al inhibir el proteasoma en la célula. Mostramos la eficacia de esta estrategia para el análisis en profundidad de los perfiles ubiquitinome de varios tipos celulares diferentes y de muestras in vivo, como el tejido cerebral. Este estudio presenta una adición original a la caja de herramientas para el análisis de ubiquitinación de proteínas para descubrir el ubiquitinomo celular profundo.
Introduction
La conjugación de ubiquitina a las proteínas las marca para la degradación por el proteosoma y es un proceso crucial en la proteostasis. El grupo carboxilo C-terminal de ubiquitina forma un enlace isopéptido con el grupo de lisina-amino de la proteína objetivo1,2. Además, la ubiquitina se puede unir a otros módulos de ubiquitina, lo que resulta en la formación de estructuras homogéneas (es decir, K48 o K11) o ramificadas (es decir, heterogéneas o mixtas) de poliubiquitina1,3. La función más conocida de la ubiquitina es su papel en la degradación proteasomal, mediada por poliubiquitina vinculada a K48. Sin embargo, ha quedado claro que tanto la mono- como la poliubiquitinación también juegan papel en muchos procesos que son independientes de la degradación por el proteosoma. Por ejemplo, las cadenas vinculadas a K63 tienen funciones no demoledor en el tráfico intracelular, la degradación issosomal, la señalización de quinasa y la respuesta de daño al ADN4,5. Los otros seis tipos de enlaces son menos abundantes y sus funciones siguen siendo en gran medida enigmáticas, aunque están surgiendo las primeras indicaciones sobre sus funciones en la célula, en gran parte debido al desarrollo de nuevas herramientas para permitir la detección específica de la vinculación6,7.
La espectrometría de masas se ha convertido en una herramienta indispensable para los análisis de proteome y hoy en día miles de proteínas diferentes de prácticamente cualquier fuente biológica se pueden identificar en un solo experimento. Una capa adicional de complejidad se presenta mediante modificaciones posttranslacionales (PTM) de proteínas (por ejemplo, fosforilación, metilación, acetilación y ubiquitinación) que pueden modular la actividad proteica. La identificación a gran escala de proteínas portadoras de PTM también ha sido posible gracias a los desarrollos en el campo de la espectrometría de masas. La estequiometría relativamente baja de péptidos que llevan PTM en comparación con sus contrapartes no modificadas presenta un desafío técnico y las etapas de enriquecimiento bioquímico son generalmente necesarias antes del análisis de espectrometría de masas. En las últimas dos décadas, se han desarrollado varios métodos de enriquecimiento específicos diferentes para el análisis de los MPT.
Debido a los roles multifacéticos de la ubiquitinación de proteínas en la célula, existe una gran demanda para el desarrollo de métodos analíticos para la detección de sitios de ubiquitinación en proteínas8. La aplicación de métodos espectrométricos de masas ha dado lugar a una explosión del número de sitios de ubiquitinación identificados en la mosca de la fruta, ratón, humano y proteínas de levadura9,10,11,12,13,14. Un paso importante fue presentado por el desarrollo de estrategias de enriquecimiento basadas en inmunoprecipitación a nivel de péptidos utilizando anticuerpos dirigidos contra el motivo remanente de K-o-GG (también conocido como ‘diglycine’ o ‘diGly’). Estos péptidos digly se producen tras la digestión de proteínas ubiquitinadas utilizando la trippsina como la proteasa15,,16.
Aquí, presentamos un flujo de trabajo optimizado para enriquecer los péptidos diglily utilizando inmunopurificación y posterior detección por espectrometría de masas Orbitrap. Usando una combinación de varias modificaciones de los flujos de trabajo existentes, especialmente en las etapas de preparación de muestras y espectrometría de masas, ahora podemos identificar rutinariamente más de 23.000 péptidos diGly de una sola muestra de células HeLa tratadas con un proteosoma inhibidor y 10.000 euros de células HeLa no tratadas. Hemos aplicado este protocolo a los lisados tanto del etiquetado de isótopos no etiquetados como estables con aminoácidos en el cultivo celular (SILAC) etiquetados células HeLa, así como a muestras endógenas como el tejido cerebral.
Este flujo de trabajo presenta una valiosa adición al repertorio de herramientas para el análisis de sitios de ubiquitinación con el fin de descubrir el ubiquitinome profundo. El protocolo siguiente describe todos los pasos del flujo de trabajo en detalle.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí se aplicó a muestras de diversas fuentes biológicas, como células cultivadas y tejido in vivo. En todos los casos identificamos miles de péptidos digly, siempre que la cantidad total de entrada de proteína sin al menos 1 mg. El enriquecimiento con anticuerpos específicos es altamente eficiente, dado que sólo a lo sumo se identificaron 100-150 péptidos digly muy bajos y abundantes a partir de lisatos de células enteras si no se aplicaron procedimientos de enriquecimiento para proteína…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo forma parte del proyecto “Proteínas en el Trabajo”, un programa del Centro de Proteómica de los Países Bajos financiado por la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO) como parte de la Hoja de Ruta Nacional de Las Instalaciones de Investigación a Gran Escala (número de proyecto 184.032.201 ).
Materials
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
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