Обнаружение мест убиквитирования белка путем обогащения пептида и масс-спектрометрии
Summary
Мы представляем метод очистки, обнаружения и идентификации диглы пептидов, которые происходят из убиквитинаированных белков из сложных биологических образцов. Представленный метод воспроизводим, надежен и превосходит опубликованные методы по уровню глубины анализа убикитиномы.
Abstract
Постпереводная модификация белков мелким белком убиквитин участвует во многих клеточных событиях. После триптического переваривания убиквитированных белков, пептиды с остатками диглицина, спряченные с группой аминокислот эпсилона (‘K—дигизина или просто ‘diGly’) могут быть использованы для отслеживания первоначального места модификации. Эффективная иммуноочищенность дигли пептидов в сочетании с чувствительным обнаружением масс-спектрометрией привела к значительному увеличению числа выявленных на сегодняшний день участков убиквитинации. Мы внесли ряд улучшений в этот рабочий процесс, в том числе в автономном режиме высокой рН обратной фазы фракции пептидов до процедуры обогащения, а также включение более продвинутых параметров фрагментации пептида в ионную размыва. Кроме того, более эффективная очистка образца с помощью фильтра на основе штепсельной вилки для того, чтобы сохранить бусы антитела приводит к большей специфичности для диGly пептидов. Эти улучшения приводят к регулярному обнаружению более 23000 диглы пептидов из клеток рака шейки матки человека (HeLa) клеточные лисаты на протеасомы ингибирование в клетке. Мы показываем эффективность этой стратегии для углубленного анализа профилей убикитиномы нескольких различных типов клеток и образцов in vivo, таких как ткани мозга. Это исследование представляет собой оригинальное дополнение к инструментарию для анализа убиквитинации белка, чтобы раскрыть глубокий клеточный убикитино.
Introduction
Спряжение убиквитина к белкам знаменует их для деградации протеасомы и является решающим процессом в протеостазе. C-терминал carboxyl группа убиквитина образует изопептид связи с лизином и амино группы целевого белка1,2. Кроме того, убиквитин может быть прикреплен к другим модулям побиквитина, что приводит к образованию однородных (т.е. K48 или K11) или разветвленных (т.е. неоднородных или смешанных) поликубиквитовых структур1,3. Наиболее известной функцией убиквитин является его роль в протеасомальной деградации, при посредничестве K48-связанных полиубиквитин. Тем не менее, стало ясно, что как моно-, так и полиубичицинация также играют роль во многих процессах, которые не зависят от деградации протеасомы. Например, цепи, связанные с K63, играют недеградную роль во внутриклеточной торговле, лисосомальной деградации, сигнализации киназы и ответе повреждения ДНК4,,5. Другие шесть типов связей менее обильные и их роли по-прежнему в значительной степени загадочные, хотя первые указания об их функциях в ячейке появляются, в основном из-за разработки новых инструментов для обеспечения связи конкретных обнаружения6,7.
Масс-спектрометрия стала незаменимым инструментом для анализа протеомов, и в настоящее время тысячи различных белков практически из любого биологического источника могут быть идентифицированы в одном эксперименте. Дополнительный уровень сложности представлен постпереводными модификациями (ПТМ) белков (например, фосфорилированием, метилированием, ацетилированием и убиквитинированием), которые могут модулировать белковую активность. Крупномасштабная идентификация PTM-несущих белков также стала возможной благодаря изменениям в области масс-спектрометрии. Относительно низкая стойчиометрия пептидов, несущих ПТМ по сравнению с их неизмененными аналогами, представляет собой техническую проблему, и шаги биохимического обогащения, как правило, необходимы до анализа масс-спектрометрии. За последние два десятилетия для анализа ПТМ было разработано несколько различных конкретных методов обогащения.
Из-за многогранной роли убиквитина белка в клетке, существует большой спрос на разработку аналитических методов для обнаружения мест убиквитина на белках8. Применение масс-спектрометрических методов привело к взрыву числа выявленных мест убиквитинации в плодовой мухе, мыши, человеческих и дрожжевых белках99,10,,11,,12,,13,14. Важным шагом стала разработка стратегий обогащения на основе иммунопрецидации на уровне пептида с использованием антител, направленных против остатков мотива K-A-GG (также называемого «диглицином» или «дигли»). Эти диглы пептиды производятся при переваривании убиквитинаированных белков с помощью трипсина в качестве протеаза15,16.
Здесь мы представляем оптимизированный рабочий процесс для обогащения диглы пептидов с помощью иммуноочищенности и последующего обнаружения масс-спектрометрией Orbitrap. Используя комбинацию нескольких модификаций существующих рабочих процессов, особенно на этапах подготовки образцов и масс-спектрометрии, мы можем регулярно идентифицировать более 23 000 пептидов диГлли из одного образца клеток HeLa, обработанных протеасомой ингибитор и 10 000 фунтов от необработанных клеток HeLa. Мы применили этот протокол к лисатам как от немаркированной, так и изотопной маркировки аминокислотами в клеточной культуре (SILAC) с маркировкой клеток HeLa, а также к эндогенным образцам, таким как ткани мозга.
Этот рабочий процесс представляет собой ценное дополнение к репертуару инструментов для анализа убиквитинации сайтов для того, чтобы раскрыть глубокий убикитино. Следующий протокол подробно описывает все этапы рабочего процесса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь протокол был применен к образцам из различных биологических источников, таких как культивированные клетки и ткани in vivo. Во всех случаях мы выявили тысячи диглы пептидов, при условии, что общее количество ввода белка было не менее 1 мг. Обогащение с использованием конкрет…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа является частью проекта “Белки на работе”, программы Нидерландского центра протеомики, финансируемого Нидерландской организацией научных исследований (НВО) в рамках Национальной дорожной карты крупномасштабных научно-исследовательских учреждений (проект No 184.032.201 ).
Materials
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review – Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
- Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
- Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
- Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
- Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
- Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
- Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
- Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
- Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
- Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
- Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
- Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
