ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

ユビキチンからタンパク質への結合は、プロテアソームによる分解を示すものであり、プロテオスタシスにおいて重要なプロセスです。ユビキチンのC末端カルボキシル基は、標的タンパク質^11,22のリジンε-アミノ基とイソペプチド結合を形成する。また、ユビキチンは他のユビキチンモジュールに付着することができ、その結果、均質(すなわち、K48またはK11)または分岐(すなわち、不均質または混合)のポリウビキチン構造^11、33の形成をもたらす。ユビキチンの最もよく知られた機能は、プロテアソーム分解におけるその役割であり、K48結合ポリウビキチンによって媒介される。しかし、モノ-とポリユビキチン化の両方が、プロテアソームによる分解とは無関係な多くのプロセスにおいて役割を果たしていることも明らかになっている。例えば、K63連結鎖は、細胞内密売、リソソーム分解、キナーゼシグナル伝達、およびDNA損傷応答^44,55において非分解的役割を有する。他の6つのリンケージタイプはあまり豊富ではなく、その役割は依然としてほとんど謎めいているが、細胞内のそれらの機能に関する最初の徴候は、主にリンケージ特異的検出^66、77を可能にする新しいツールの開発のために出現している。

質量分析はプロテオーム解析に欠かせないツールとなっており、現在では、事実上あらゆる生物学的源から数千種類の異なるタンパク質を1回の実験で同定することができます。複雑さの追加の層は、タンパク質活性を調節することができるタンパク質の翻訳後修飾(PTM)のタンパク質(例えば、リン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化)によって提示される。PTMを含むタンパク質の大規模同定は、質量分析分野の発展によっても可能となっています。PTMを持つペプチドの比較的低い化学測定は、その非修飾の対応物と比較して技術的な課題を提示し、一般的に質量分析の前に生化学的濃縮ステップが必要です。過去20年間、PTMの分析のためにいくつかの異なる特異的な濃縮方法が開発されました。

細胞内のタンパク質ユビキチン化の多面的役割のため、タンパク質⁸上のユビキチン化部位の検出のための分析方法の開発に大きな需要がある。^,質量分析法の適用は、フルーツフライ、マウス、ヒト、および酵母タンパク質^{,,9、10、11、12、13、1410,}中の⁹同定されたユビキチン化部位の数の爆発に至^った。¹¹¹²¹³主要なステップは、K-ε-GGレムナントモチーフ(‘diglycine’または「diGly」とも呼ばれる)に対する抗体を用いたペプチドレベルでの免疫沈降ベースの濃縮戦略の開発によって提示された。これらのdiGlyペプチドは、プロテア^{ーゼ15、16,16}としてトリプシンを使用してユビキチン化タンパク質の消化時に産生される。

ここでは、眼窩質量分析法による免疫精製とその後の検出を用いて、diGlyペプチドを濃縮するための最適化されたワークフローを提示する。既存のワークフローのいくつかの変更の組み合わせを使用して、特にサンプル調製および質量分析段階で、プロテアソームで処理されたHeLa細胞の単一サンプルから23,000以上のdiGlyペプチドを日常的に同定できるようになりました。阻害剤および、治療されていないHeLa細胞から〜10,000。このプロトコルは、細胞培養中のアミノ酸による標識のない安定同位体(SILAC)のHeLa細胞と脳組織などの内因性サンプルの両方に、このプロトコルを適用しました。

このワークフローは、深いユビキチノメを明らかにするために、ユビキチン化部位の分析のためのツールのレパートリーに貴重な追加を提示します。次のプロトコルは、ワークフローのすべての手順を詳細に説明します。