Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa
Summary
Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l’identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell’analisi dell’ubiquitinome.
Abstract
La modifica post-traduzionale delle proteine da parte della piccola ubiquitina proteica è coinvolta in molti eventi cellulari. Dopo la digestione trittica delle proteine ubiquitinate, i peptidi con un residuo di diglycine coniugato al gruppo di amminomido epsilon della lisina (‘K-z-diglycine’ o semplicemente ‘diGly’) possono essere utilizzati per rintracciare il sito di modifica originale. L’immunopurificazione efficiente dei peptidi diGly combinata con il rilevamento sensibile mediante spettrometria di massa ha portato a un enorme aumento del numero di siti di ubiquitinazione identificati fino ad oggi. Abbiamo apportato diversi miglioramenti a questo flusso di lavoro, tra cui la frazione offline ad alta fase inversa di peptidi prima della procedura di arricchimento e l’inclusione di impostazioni di frammentazione peptide più avanzate nel multipolo di routing io. Inoltre, la pulizia più efficiente del campione utilizzando un tappo basato su filtro al fine di mantenere le perline anticorpali si traduce in una maggiore specificità per i peptidi diGly. Questi miglioramenti si traducono nella rilevazione di routine di più di 23.000 peptidi diGly da cellule tumorali cervicali umane (HeLa) lismi cellulari su inibizione proteasoso nella cellula. Mostriamo l’efficacia di questa strategia per un’analisi approfondita dei profili ubiquitinomi di diversi tipi di cellule e di campioni in vivo, come il tessuto cerebrale. Questo studio presenta un’originale aggiunta alla cassetta degli attrezzi per l’analisi dell’ubiquitinazione delle proteine per scoprire l’ubiquitimo cellulare profondo.
Introduction
La coniugazione dell’ubiquitina alle proteine le segna per la degradazione da parte del proteasome ed è un processo cruciale nella proteostasi. Il gruppo carboxyl c-terminale di ubiquitina forma un legame isopeptide con la lisina-aminogruppo della proteina bersaglio1,2. Inoltre, l’ubiquitina può essere collegata ad altri moduli di ubiquitina, con conseguente formazione di strutture omogenee (cioè, K48 o K11) o ramificate (cioè strutture di polianiquitina eterogenee o miste)1,3. La funzione più nota dell’ubiquitina è il suo ruolo nella degradazione proteasomica, mediato dalla poliubiquitina legata al K48. Tuttavia, è diventato chiaro che sia la mono- che la poliubiquitinazione svolgono anche ruoli in molti processi che sono indipendenti dalla degradazione da parte del proteasome. Per esempio, le catene legate al K63 hanno ruoli non degradanti nel traffico intracellulare, nella degradazione lsosomica, nella segnalazione della chinasi e nella risposta al danno del DNA4,5. Gli altri sei tipi di collegamento sono meno abbondanti e i loro ruoli sono ancora in gran parte enigmatici, anche se stanno emergendo le prime indicazioni sulle loro funzioni nella cellula, in gran parte a causa dello sviluppo di nuovi strumenti per consentire il rilevamento specifico del collegamento6,7.
La spettrometria di massa è diventata uno strumento indispensabile per le analisi del proteoma e al giorno d’oggi migliaia di proteine diverse da praticamente qualsiasi fonte biologica possono essere identificate in un singolo esperimento. Un ulteriore strato di complessità è presentato da modifiche post-traduzionali (PTM) di proteine (ad esempio, fosforolalazione, metilazione, acetilazione e ubiquitinazione) che possono modulare l’attività delle proteine. L’identificazione su larga scala delle proteine che portano il PTM è stata resa possibile anche dagli sviluppi nel campo della spettrometria di massa. La stoichiometria relativamente bassa dei peptidi con PTM rispetto alle loro controparti non modificate presenta una sfida tecnica e le fasi di arricchimento biochimico sono generalmente necessarie prima dell’analisi della spettrometria di massa. Negli ultimi due decenni, sono stati sviluppati diversi metodi di arricchimento specifici per l’analisi dei PTM.
A causa dei molteplici ruoli dell’ubiquitinazione proteica nella cellula, c’è una grande domanda per lo sviluppo di metodi analitici per il rilevamento di siti di ubiquitinazione sulle proteine8. L’applicazione di metodi spettrometrici di massa ha portato ad un’esplosione del numero di siti di ubiquitinazione identificati nelle proteine della mosca della frutta, del topo, dell’uomo e del lievito9,10,11,12,13,14. Un passo importante è stato rappresentato dallo sviluppo di strategie di arricchimento basate sull’immunoprecipitazioni a livello di peptide utilizzando anticorpi diretti contro il motivo residuo di K-e-GG (chiamato anche ‘diglycine’ o ‘diGly’). Questi peptidi diGly sono prodotti sulla digestione di proteine ubiquitinate utilizzando la trypsina come proteasi15,16.
Qui, presentiamo un flusso di lavoro ottimizzato per arricchire per peptidi diGly utilizzando l’immunopurificazione e la successiva rilevazione da parte della spettrometria di massa Orbitrap. Utilizzando una combinazione di diverse modifiche dei flussi di lavoro esistenti, specialmente nelle fasi di preparazione del campione e spettrometria di massa, ora possiamo identificare regolarmente più di 23.000 peptidi diGly da un singolo campione di cellule HeLa trattate con un proteasome inibitore e 10.000 dollari da cellule HeLa non trattate. Abbiamo applicato questo protocollo a lisati sia da etichettatura isotoma sia non etichettata che stabile con aminoacidi nella coltura cellulare (SILAC) etichettati cellule HeLa così come a campioni endogeni come il tessuto cerebrale.
Questo flusso di lavoro presenta una preziosa aggiunta al repertorio di strumenti per l’analisi dei siti di ubiquitinazione al fine di scoprire il profondo ubiquitinome. Il protocollo seguente descrive in dettaglio tutti i passaggi del flusso di lavoro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto è stato applicato a campioni provenienti da varie fonti biologiche, come cellule coltivate e tessuto in vivo. In tutti i casi abbiamo identificato migliaia di peptidi diGly, a condizione che la quantità totale di ingresso proteica fosse di almeno 1 mg. L’arricchimento con anticorpi specifici è altamente efficiente, dato che solo al massimo 100-150 peptidi diGly molto bassi sono stati identificati da lismi a tutta cellula se non sono state applicate procedure di arricchimento per proteine ub…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro fa parte del progetto “Proteins at Work”, un programma del Centro di Proteomica dei Paesi Bassi finanziato dall’Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) nell’ambito della National Roadmap Large-Scale Research Facilities (numero di progetto 184.032.201 ).
Materials
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
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