Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse
Summary
Nous présentons une méthode pour la purification, la détection et l’identification des peptides diGly qui proviennent de protéines ubiquitinées à partir d’échantillons biologiques complexes. La méthode présentée est reproductible, robuste et surpasse les méthodes publiées par rapport au niveau de profondeur de l’analyse ubiquitinome.
Abstract
La modification posttranslationnelle des protéines par la petite ubiquitine protéique est impliquée dans de nombreux événements cellulaires. Après la digestion tryptique des protéines ubiquitinées, les peptides avec un reste de diglycine conjugués au groupe aminé d’epsilon de lysine (‘K-‘diglycine’ ou simplement ‘diGly’) peuvent être utilisés pour suivre le site original de modification. L’immunopurification efficace des peptides diGly combinés à la détection sensible par spectrométrie de masse a entraîné une augmentation considérable du nombre de sites d’ubiquitination identifiés à jour. Nous avons apporté plusieurs améliorations à ce flux de travail, y compris la fractionnation hors ligne de la phase inverse de pH des peptides avant la procédure d’enrichissement, et l’inclusion de paramètres plus avancés de fragmentation de peptide dans le multipole de routage d’ion. En outre, un nettoyage plus efficace de l’échantillon à l’aide d’un bouchon filtré afin de conserver les perles d’anticorps entraîne une plus grande spécificité pour les peptides diGly. Ces améliorations ont comme conséquence la détection courante de plus de 23.000 peptides diGly des cellules cancéreuses humaines de cervical (HeLa) cellules lysates sur l’inhibition protéasome dans la cellule. Nous montrons l’efficacité de cette stratégie pour une analyse approfondie des profils ubiquitinome de plusieurs types de cellules et d’échantillons in vivo, tels que les tissus cérébraux. Cette étude présente un ajout original à la boîte à outils pour l’analyse d’ubiquitination des protéines pour découvrir l’ubiquitinome cellulaire profond.
Introduction
La conjugaison de l’ubiquitine aux protéines les marque pour la dégradation par le protéasome et est un processus crucial dans la protéostasie. Le groupe carboxyl C-terminal d’ubiquitine forme un lien isopeptide avec le groupe lysine ‘amino de la protéine cible1,2. En outre, l’ubiquitine peut être attachée à d’autres modules d’ubiquitine, résultant en la formation de structures homogènes (c.-à-d., K48 ou K11) ou ramifiées (c.-à-d. hétérogènes ou mixtes) structures de polyubiquitine1,3. La fonction la plus connue de l’ubiquitine est son rôle dans la dégradation protéasomique, médiée par la polyubiquitine liée à K48. Cependant, il est devenu clair que la mono- ainsi que la polyubiquitination jouent également des rôles dans de nombreux processus qui sont indépendants de la dégradation par le protéasome. Par exemple, les chaînes liées au K63 ont des rôles non dégradants dans le trafic intracellulaire, la dégradation lysosomale, la signalisation de la kinase et la réponse des dommages d’ADN4,5. Les six autres types de liaison sont moins abondants et leurs rôles sont encore largement énigmatiques, bien que les premières indications sur leurs fonctions dans la cellule émergent, en grande partie en raison du développement de nouveaux outils pour permettre la détection spécifique à la liaison6,7.
La spectrométrie de masse est devenue un outil indispensable pour les analyses de protéome et de nos jours des milliers de protéines différentes de pratiquement n’importe quelle source biologique peuvent être identifiées dans une seule expérience. Une couche supplémentaire de complexité est présentée par des modifications posttranslationnelles (PTM) de protéines (p. ex., phosphorylation, méthylation, acétylation et ubiquitination) qui peuvent moduler l’activité protéique. L’identification à grande échelle des protéines porteuses de PTM a également été rendue possible par les développements dans le champ de spectrométrie de masse. La stoichiométrie relativement faible des peptides portant des SMPT par rapport à leurs homologues non modifiés présente un défi technique et des étapes d’enrichissement biochimique sont généralement nécessaires avant l’analyse de spectrométrie de masse. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs méthodes d’enrichissement spécifiques ont été développées pour l’analyse des MPT.
En raison des rôles multiformes de l’ubiquitination des protéines dans la cellule, il ya une grande demande pour le développement de méthodes analytiques pour la détection des sites d’ubiquitination sur les protéines8. L’application de méthodes spectrométriques de masse a conduit à une explosion du nombre de sites d’ubiquitination identifiés dans les protéines de mouche des fruits, souris, humains et levures9,10,11,12,13,14. Une étape majeure a été présentée par le développement de stratégies d’enrichissement basées sur l’immunoprécipitation au niveau du peptide à l’aide d’anticorps dirigés contre le motif de reste K-GG (également appelé «diglycine» ou «diGly»). Ces peptides diGly sont produits sur la digestion des protéines ubiquitinées utilisant la trypsine comme la protéase15,16.
Ici, nous présentons un flux de travail optimisé pour enrichir les peptides diGly à l’aide de l’immunopurification et de la détection ultérieure par spectrométrie de masse Orbitrap. À l’aide d’une combinaison de plusieurs modifications des flux de travail existants, en particulier dans les étapes de préparation de l’échantillon et de spectrométrie de masse, nous pouvons maintenant identifier systématiquement plus de 23 000 peptides diGly provenant d’un seul échantillon de cellules HeLa traitées avec un protéasome inhibiteur et 10 000 euros provenant de cellules HeLa non traitées. Nous avons appliqué ce protocole aux lysates de l’étiquetage isotopique non étiqueté et stable avec des acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) étiquetés cellules HeLa ainsi que pour des échantillons endogènes tels que le tissu cérébral.
Ce flux de travail présente un ajout précieux au répertoire d’outils pour l’analyse des sites d’ubiquitination afin de découvrir l’ubiquitinome profond. Le protocole suivant décrit en détail toutes les étapes du flux de travail.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici a été appliqué à des échantillons provenant de diverses sources biologiques, telles que les cellules cultivées et le tissu in vivo. Dans tous les cas, nous avons identifié des milliers de peptides diGly, à condition que la quantité totale d’entrée de protéine était au moins 1 mg. L’enrichissement à l’aide d’anticorps spécifiques est très efficace, étant donné que seulement au plus 100-150 peptides diGly abondants très bas ont été identifiés à partir de lysates cellul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux s’ursent dans le cadre du projet “Proteins at Work”, un programme du Centre de protéomique des Pays-Bas financé par l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) dans le cadre des installations nationales de recherche à grande échelle (projet numéro 184.032.201 ).
Materials
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
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