Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie
Summary
We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.
Abstract
De posttranslationele modificatie van eiwitten door de kleine eiwitubiquitine is betrokken bij vele cellulaire gebeurtenissen. Na tryptische vertering van ubiquitinated eiwitten, peptiden met een diglycine rest geconjugeerd aan de epsilon aminogroep van lysine (‘K-ε-diglycine’ of gewoon ‘diGly’) kan worden gebruikt om de oorspronkelijke modificatie site terug te volgen. Efficiënte immunozuivering van diGly peptiden in combinatie met gevoelige detectie door massaspectrometrie heeft geresulteerd in een enorme toename van het aantal ubiquitinatiesites dat up-to-date is geïdentificeerd. We hebben verschillende verbeteringen aangebracht in deze workflow, waaronder offline hoge pH reverse-phase fractionatie van peptiden voorafgaand aan de verrijkingsprocedure, en de opname van meer geavanceerde peptide fragmentatie-instellingen in de ionenroutering multipole. Ook, efficiënter opruimen van het monster met behulp van een filter-gebaseerde plug om de antilichaam kralen te behouden resulteert in een grotere specificiteit voor diGly peptiden. Deze verbeteringen resulteren in de routinedetectie van meer dan 23.000 diGly peptiden uit menselijke cervicale kankercellen (HeLa) cellysaten bij proteasoomremming in de cel. We tonen de werkzaamheid van deze strategie voor diepgaande analyse van de ubiquitinomenprofielen van verschillende celtypen en van in vivo monsters, zoals hersenweefsel. Deze studie presenteert een originele aanvulling op de toolbox voor eiwitubiquitinatie analyse om de diepe cellulaire ubiquitinomen te ontdekken.
Introduction
De vervoeging van ubiquitine aan eiwitten markeert ze voor afbraak door het proteasoom en is een cruciaal proces in proteostase. De C-terminalcarboxylgroep van ubiquitine vormt een isopeptide band met de lysine ε-aminogroep van het doeleiwit1,2. Bovendien kan ubiquitine worden bevestigd aan andere ubiquitinemodules, wat resulteert in de vorming van homogene (d.w.z. K48 of K11) of vertakte (d.w.z. heterogene of gemengde) polyubiquitinestructuren1,3. De meest bekende functie van ubiquitine is zijn rol in proteasomale afbraak, bemiddeld door K48-gebonden polyubiquitine. Het is echter duidelijk geworden dat zowel mono- als polyubiquitinatie ook een rol spelen in vele processen die onafhankelijk zijn van afbraak door het proteasoom. K63-gebonden ketens hebben bijvoorbeeld niet-degradatieve rollen in intracellulaire handel, lysosomale afbraak, kinase signalering, en de DNA-schaderespons4,5. De andere zes koppelingstypen zijn minder overvloedig en hun rollen zijn nog steeds grotendeels raadselachtig, hoewel de eerste aanwijzingen over hun functies in de cel in opkomst zijn, grotendeels vanwege de ontwikkeling van nieuwe instrumenten om koppelingsspecifieke detectie mogelijk te maken6,7.
Massaspectrometrie is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument voor proteomen analyses en tegenwoordig duizenden verschillende eiwitten uit vrijwel elke biologische bron kan worden geïdentificeerd in een enkel experiment. Een extra laag van complexiteit wordt gepresenteerd door posttranslationele modificaties (PTMs) van eiwitten (bijvoorbeeld fosforylatie, methylatie, acetylatie en ubiquitinatie) die eiwitactiviteit kunnen moduleren. Grootschalige identificatie van PTM-dragende eiwitten is ook mogelijk gemaakt door ontwikkelingen op het gebied van massaspectrometrie. De relatief lage stoimaginetry van peptiden met PTM’s in vergelijking met hun ongewijzigde tegenhangers vormt een technische uitdaging en biochemische verrijkingsstappen zijn over het algemeen noodzakelijk voorafgaand aan de massaspectrometrieanalyse. In de afgelopen twee decennia zijn verschillende specifieke verrijkingsmethoden ontwikkeld voor de analyse van PtM’s.
Vanwege de veelzijdige rollen van eiwitubiquitinatie in de cel, is er een grote vraag naar de ontwikkeling van analytische methoden voor de detectie van ubiquitinatiesites op eiwitten8. De toepassing van massaspectrometrische methoden heeft geleid tot een explosie van het aantal geïdentificeerde ubiquitinatieplaatsen in fruitvlieg-, muizen-, menselijke en gisteiwitten9,10,1111,12,13,14. Een belangrijke stap werd gepresenteerd door de ontwikkeling van op immunoneerslag gebaseerde verrijkingsstrategieën op peptideniveau met behulp van antilichamen gericht tegen het K-ε-GG-restmotief (ook wel ‘diglycine’ of ‘diGly’ genoemd). Deze diGly peptiden worden geproduceerd bij de vertering van ubiquitineerde eiwitten met trypsine als protease15,16.
Hier presenteren we een geoptimaliseerde workflow om te verrijken voor diGly peptiden met behulp van immunozuivering en daaropvolgende detectie door Orbitrap massaspectrometrie. Met behulp van een combinatie van verschillende wijzigingen van bestaande workflows, vooral in de monstervoorbereidings- en massaspectrometriestadia, kunnen we nu routinematig meer dan 23.000 diGly peptiden identificeren uit een enkel monster van HeLa-cellen die met een proteasoom worden behandeld remmer en ~ 10.000 uit onbehandelde HeLa-cellen. We hebben dit protocol toegepast op lysaten van zowel ongelabelde als stabiele isotopenetikettering met aminozuren in celkweek (SILAC) met het label HeLa-cellen en op endogene monsters zoals hersenweefsel.
Deze workflow vormt een waardevolle aanvulling op het repertoire van tools voor de analyse van ubiquitinatiesites om de diepe ubiquitinomen te ontdekken. Het volgende protocol beschrijft alle stappen van de werkstroom in detail.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol werd toegepast op monsters uit verschillende biologische bronnen, zoals gekweekte cellen en in vivo weefsel. In alle gevallen identificeerden we duizenden diGly peptiden, op voorwaarde dat de totale eiwitinput hoeveelheid ten minste 1 mg was. De verrijking met behulp van specifieke antilichamen is zeer efficiënt, gezien het feit dat slechts maximaal 100-150 zeer lage overvloedige diGly peptiden werden geïdentificeerd uit hele cellysaten als er geen verrijkingsprocedures voor ubiquitineerde …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk maakt deel uit van het project “Proteins at Work”, een programma van het Nederlands Proteomics Centrum gefinancierd door NWO in het kader van de Nationale Roadmap Grootschalige Onderzoeksfaciliteiten (projectnummer 184.032.201 ).
Materials
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review – Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
- Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
- Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
- Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
- Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
- Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
- Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
- Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
- Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
- Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
- Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
- Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
