الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي
Summary
نحن نقدم طريقة لتنقية والكشف وتحديد الببتيدات diGly التي تنشأ من البروتينات في كل مكان من عينات بيولوجية معقدة. الطريقة المعروضة قابلة للاستنساخ وقوية وتتفوق على الأساليب المنشورة فيما يتعلق بمستوى عمق تحليل كل يوم.
Abstract
التعديل بعد التحويل ية للبروتينات بواسطة البروتين الصغير في كلمكانفيا تشارك في العديد من الأحداث الخلوية. بعد الهضم الtryptic من البروتينات في كل مكان، يمكن استخدام الببتيدات مع بقايا diglycine مترافقة مع مجموعة أمينية إبسيلون من الليسين (‘K-а-diglycine’ أو ببساطة ‘diGly’) لتتبع موقع التعديل الأصلي. وقد أدى التنقية المناعية الفعالة من الببتيدات diGly جنبا إلى جنب مع الكشف الحساس عن طريق قياس الطيف الكتلي إلى زيادة كبيرة في عدد مواقع التعامي التي تم تحديدها حتى الآن. لقد قمنا بإجراء العديد من التحسينات على سير العمل هذا ، بما في ذلك تجزئة المرحلة العكسية عالية في عدم الاتصال بـ pH من الببتيدات قبل إجراء الإثراء ، وإدراج إعدادات تجزئة الببتيد الأكثر تقدمًا في متعدد القطب لتوجيه الأيون. أيضا، تنظيف أكثر كفاءة من العينة باستخدام المكونات القائمة على مرشح من أجل الاحتفاظ حبات الأجسام المضادة يؤدي إلى مزيد من التحديد للببتيدات diGly. هذه التحسينات تؤدي إلى الكشف الروتيني لأكثر من 23،000 الببتيدات diGly من خلايا سرطان عنق الرحم البشرية (هيلا) التحلل على تثبيط البروتينفي الخلية. نظهر فعالية هذه الاستراتيجية للتحليل المتعمق لمحات كليوموكلوتينوم من عدة أنواع مختلفة من الخلايا وفي عينات الجسم الحي، مثل أنسجة الدماغ. تقدم هذه الدراسة إضافة أصلية إلى صندوق الأدوات لتحليل انتشار البروتين للكشف عن كل يوم في كل مكان خلوي عميق.
Introduction
اقتران ubiquitin إلى البروتينات علامات عليها لتدهور من قبل proteasome وهي عملية حاسمة في البروتوستاس. مجموعة C-المحطة الكاربوكسيلي من ubiquitin يشكل رابطة isopeptide مع مجموعة ليسين من البروتين المستهدف1,2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إرفاق ubiquitin بوحدات ubiquitin الأخرى ، مما يؤدي إلى تشكيل هياكل بوليوبيكوتين متجانسة (أي K48 أو K11) أو متفرعة (أي غير متجانسة أو مختلطة) هياكل البوليوبيكوتين1،3. الوظيفة الأكثر شهرة من ubiquitin هو دوره في تدهور بروتياسومي، بوساطة polyubiquitin K48 المرتبطة. ومع ذلك ، فقد أصبح من الواضح أن كل من أحادية ، وكذلك polyubiquitination تلعب أيضا أدوارا في العديد من العمليات التي هي مستقلة عن تدهور من قبل proteasome. على سبيل المثال، سلاسل K63 المرتبطة لها أدوار غير مُنُهِية في الاتجار داخل الخلايا، وتدهور الليسوسومي، وإشارات الكيناز، واستجابة تلف الحمض النووي4،,5. الأنواع الستة الأخرى الروابط هي أقل وفرة وأدوارها لا تزال غامضة إلى حد كبير، على الرغم من أن المؤشرات الأولى حول وظائفها في الخلية بدأت تظهر، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى تطوير أدوات جديدة لتمكين الكشف عن الروابط الخاصة6,7.
أصبح قياس الطيف الكتلي أداة لا غنى عنها لتحليل البروتينات وفي الوقت الحاضر يمكن تحديد الآلاف من البروتينات المختلفة من أي مصدر بيولوجي تقريبًا في تجربة واحدة. يتم تقديم طبقة إضافية من التعقيد عن طريق التعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) من البروتينات (على سبيل المثال، الفوسفور، الميثيل، الأسيتيل، وubiquitination) التي يمكن أن تعدل نشاط البروتين. كما أصبح التحديد الواسع النطاق للبروتينات الحاملة لـ PTM ممكناً بسبب التطورات في مجال قياس الطيف الكتلي. إن قياس الببتيدات المنخفض نسبياً والحامل لـ PTMs مقارنة بنظيراتها غير المعدلة يمثل تحدياً تقنياً، وخطوات الإثراء البيوكيميائية ضرورية بشكل عام قبل تحليل قياس الطيف الكتلي. وعلى مدى العقدين الماضيين، تم تطوير عدة أساليب تخصيب محددة مختلفة لتحليل تدابير التخصيب المتعددة الجوانب.
بسبب الأدوار المتعددة الأوجه للبروتين في كل مكان في الخلية ، هناك طلب كبير على تطوير الطرق التحليلية للكشف عن مواقع التعامي على البروتينات8. وقد أدى تطبيق أساليب الطيف الشامل إلى انفجار عدد المواقع المحددة في كل مكان في ذبابة الفاكهة والفأر والإنسان والخميرة البروتينات9،10،1111،12،13،14. وقد تم تقديم خطوة رئيسية من خلال تطوير استراتيجيات الإثراء القائمة على الترسيب المناعي على مستوى الببتيد باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد زخارف بقايا K-а-GG (يشار إليها أيضًا باسم “diglycine” أو “diGly”). يتم إنتاج هذه الببتيدات diGly عند هضم البروتينات في كل مكان باستخدام التربسين كما البروتياز15,16.
هنا ، نقدم سير عمل محسن لإثراء الببتيدات diGly باستخدام الببتيدات المناعية والكشف اللاحق عن طريق قياس الطيف الكتلي Orbitrap. باستخدام مزيج من عدة تعديلات على سير العمل الحالي ، وخاصة في إعداد العينة ومراحل قياس الطيف الكتلي ، يمكننا الآن تحديد أكثر من 23000 ببتيد diGly بشكل روتيني من عينة واحدة من خلايا HeLa تعامل مع بروتيجسوم مثبط و ~ 10،000 من خلايا هيلا غير المعالجة. لقد طبقنا هذا البروتوكول على الليسات من كل من تسمية النظائر غير المسماة ومستقرة مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (SILAC) المسماة خلايا هيلا وكذلك إلى عينات داخلية مثل أنسجة الدماغ.
يقدم سير العمل هذا إضافة قيمة إلى ذخيرة أدوات لتحليل مواقع الكلى من أجل الكشف عن الكلوتينيوم العميق. يصف البروتوكول التالي كافة خطوات سير العمل بالتفصيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطبيق البروتوكول الموصوف هنا على عينات من مصادر بيولوجية مختلفة، مثل الخلايا المستزرعة وفي أنسجة الجسم الحي. في جميع الحالات حددنا الآلاف من الببتيدات diGly، شريطة أن يكون إجمالي كمية مدخلات البروتين 1 ملغ على الأقل. الإثراء باستخدام أجسام مضادة محددة فعالة للغاية ، بالنظر إلى أنه تم تحد?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل هو جزء من مشروع “البروتينات في العمل”، وهو برنامج للمركز الهولندي للبروتيوميات الذي تموله المنظمة الهولندية للبحث العلمي كجزء من خارطة الطريق الوطنية على نطاق واسع مرافق البحوث (المشروع رقم 184.032.201 ).
Materials
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
References
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review – Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
- Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
- Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
- Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
- Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
- Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
- Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
- Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
- Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
- Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
- Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
- Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
