Moleküler mekikler Powered by geri dönülebilir olarak montaj Kinesins bağlı

1. çözüm hazırlık Dikkat: Bu protokol (Toluen, dimethyldichlorosilane ve dithiothreitol) için kullanılan reaktifler üçü çok zehirli. Lütfen kullanım öncesinde ilgili malzeme güvenlik bilgi formları (MSDS) başvurun. Ayrıca, bu iletişim kuralı bölümlerini koruma belirtildiği gibi koruyucu gözlük ve koruyucu eldiven iki takım giyen, daha yüksek düzeyde altında gerçekleştirilmesi gerekir. Tüm uygun kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, eldiven, önlük, tam uzunlukta pantolon ve kapalı-toe ayakkabı) kullanırken aksi tavsiye sürece deneyler laboratuvar bankların üzerinde gerçekleştirilebilir. Not: ATP, kinesin ve bu protokol için kullanılan mikrotübüller konsantrasyonları her deney ihtiyaçlarını göz önüne alındığında değiştirilebilir. Ancak, değişikliğin yapılması durumunda, lütfen diğer reaktifleri son konsantrasyonları verilen aynı kalır aşağıdaki emin olun. Oda sıcaklığında (~ 25 ° C) tüm deneyler yapıldı. Hisse senedi çözümleri hazırlanmasıNot: Hazırlamak ve aliquot önceden aşağıdaki çözümleri. Tüm aliquots oda sıcaklığında (~ 25 ° C) hazırlanabilir. BRB80 arabellekNot: Bu protokol için kullanılan çözüm çoğu için arabellek BRB80 olur. BRB80 büyük miktarlarda hazır ve -20 ° C-dondurucu içinde depolanır. 24.2 g dağıtılması piperazin-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (boru) ve 3.1 g potasyum hidroksit (KOH) 800 ml deiyonize su çalışma 800 mL 100 mM boru yapmak için. PH 8 potasyum hidroksit (KOH) ile boru ve EGTA dağılmasına yardımcı olabilir 1 L. Şardon son hacmi elde etmek için 10 mM magnezyum klorür (MgCl2) ve 10 mM etilen glikol tetraacetic asit (EGTA) 100 mL 100 mL ekleyin.Not: 80 mM borular, 1 mM MgCl2ve 1 mM EGTA kimyasallar BRB80 arabellek son konsantrasyonları vardır. PH 6,9 KOH ve hidroklorik asit (HCl) kullanarak için arabelleği ayarlayın. ATP 100 mm ATP Ultrasaf Su 1 mL solüsyon hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-80 ° C dondurucuda saklayın. GTP 25 mM GTP Ultrasaf Su 500 μL çözeltisi hazırlamak. Damlalıklı çözüm 5 μL aliquots içine. Aliquots-80 ° C dondurucuda saklayın. MgCl2 100 mm MgCl2 Ultrasaf Su 1 mL solüsyon hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın. Kazein Kuru kazein 1 g tartmak ve 50 mL konik santrifüj tüpü aktar. BRB80 arabellek 35 mL tüp kazein toz çözülmeye ekleyin. Çözüm bir bardak soğuk bir odada gece çözülmeye yerleştirin. Bu noktada, çözüm kalın ve yapışkan bakacağız. Tüp dik yerleşmek herhangi bir büyük undissolved kümeleri için izin vermek için 4 ° C buzdolabı bırakın. Süpernatant için yeni bir tüp aktarın. Daha fazla precipitates cips için 1000 x g de bir santrifüj tüpü çevir. Bir kez daha, yeni bir tüp süpernatant aktarın. Art arda 0,2 mikron (7 bar maksimum basınç) filtreleri kullanarak çözüm filtre. Kadar kalın olduğunu çözüm, fazla filtresi tıkanmış olsun, bu yüzden filtre temizlenene kadar bu adımı yineleyin ve unclogged. Kazein konsantrasyonu 280 nm20, kazein’ın nesli 19 mM-1∙cm-1 katsayısı kullanarak UV/Vis spectrophotometry kullanarak elde edilen çözelti içinde belirlemek. Kazein için 23 kDa bir molekül ağırlığı varsayarsak, 20 mg∙mL-1 BRB80 içinde bir konsantrasyon çözümü oranında seyreltin. Damlalıklı çözüm içine 20 μL aliquots ve aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın. D-glikoz 2 M D-glikoz Ultrasaf Su 1 mL solüsyon hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın. Glikoz oksidaz 20 mg∙mL-1 glikoz oksidaz BRB80 1 mL çözeltisi hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın. Katalaz BRB80 0.8 mg∙mL-1 katalaz, 1 mL solüsyon hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın. Dithiothreitol (DTT)Not: DTT biraz uçucu ve zehirli olduğu için lütfen bir duman başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin. 1 m ultrasaf suda seyreltilmiş DTT 1 mL solüsyon hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın. Paklitaksel 1 mM paklitaksel DMSO içinde seyreltilmiş 1 mL çözeltisi hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın. Dimetil sülfoksit (DMSO)Not: Bu deneylerde kullanılan DMSO saftır. Saf DMSO 10 μL aliquots içine 1 mL damlalıklı. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın. Kreatin fosfat 0.2 M kreatin fosfat Ultrasaf Su, 1 mL solüsyon hazırlamak. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın. Kreatin fosfokinaz 200 units· bir 1 mL solüsyon hazırlamak L-1 kreatin fosfokinaz Ultrasaf Su. Damlalıklı çözüm 10 μL aliquots içine. Aliquots-20 ° C dondurucuda saklayın. Nikel (II) sülfat 500 mL lik 50 mM nikel (II) sülfat Ultrasaf Su hazırlamak. Çözüm (~ 25 ° C) Oda sıcaklığında saklayın. Poly(Ethylene glycol)-blok-poly(propylene glycol)-blok-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) çözüm PEG-PPG-PEG 2 mg tartmak (sayı ortalama molekül ağırlığı: 14.600 g∙mol-1)-NTA toz ağırlığında kağıt üzerinde. PEG-PPG-PEG-NTA nitrilotriacetic asit (NTA) grubuyla functionalized triblock kopolimer var. PEG-PPG-PEG-NTA hakkında daha fazla bilgi için Tablo reçetesi bakın. Toz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 1 mL stok nikel (II) sülfat çözeltisi tüp ekleyin. Toz eriyene kadar girdap ve hiçbir görünür kümeleri kalır. Mağaza oda sıcaklığında en fazla bir ay. Bir deney başlamadan önce Bir kova buz ile doldurun. Her birinden 1.1.1-1.1.13 yukarıdaki bölümlerde açıklanan 13 reaktifler bir aliquot alıp onları böylece onları buza tutmak kova ekleyin. Her kullanımdan önce reaktifler bir çözülme. Mikrotubul hazırlıkNot: Mikrotübüller liyofilize tübülin boya etiketli bir 20 μg aliquot polimerli. 647 uyarma dalga boyu boya olduğunu nm. Mikrotubul büyüme arabellek hazırlanması Damlalıklı 21,8 μL BRB80 arabelleği bir küçük (0.6 mL) microcentrifuge içine tüp. MgCl2 hisse senedi çözüm 1 μL, GTP hisse senedi çözeltinin 1 μL ve 1.2 μL DMSO hisse senedi çözüm ekleyin.Not: Böylece, 4 mM MgCl2, 1 mM GTP ve %5 (v/v) dimetil sülfoksit BRB80 arabellek reaktifleri son konsantrasyonları vardır. Mikrotubul polimerizasyonu 6.25 μL Mikrotubul büyüme arabelleği doğrudan bir 20 μg aliquot etiketli liyofilize tübülin in ekleyin. Girdap aliquot 5 için 30 rps s. 5 min için buzda aliquot için 45 dk 37 ° C’de kuluçka önce serin ve 1.3.3 bölümüne geçin. Mikrotubul sabitleme 5 μL bölünmemeli paklitaksel çözüm BRB80 arabellek 490 μL için ekleyin. Girdap çözüm için 10 30 rps s. Kuluçka mikrotübüller için 45 dk olduğunda, BRB80/paklitaksel 5 μL polimerli Mikrotubul çözüm ekleyin.Not: Bu 100-fold sulandırılmış, stabilize, Mikrotubul çözüm bundan sonra MT100 sevk edilecek. 5 gün için kullanılabilir ve her deneme için istenen Mikrotubul yoğunluğu elde etmek için seyreltilmiş. Motilite çözüm Enzimatik antifade, sistemi yeniden ATP ve ATP 9.0 μL bölünmemeli kazein çözüm BRB80 arabellek 291 μL için ekleyin. Deney için istenen ATP konsantrasyonu 1 mM, damlalıklı 83 μL yeni 0.6 mL microcentrifuge tüp içine BRB80/kazein çözümün daha düşük ise. Aksi takdirde, damlalıklı 85 μL o çözüm yeni bir 0.6 mL microcentrifuge tüp içine. D-glikoz, glikoz oksidaz 1 μL, katalaz 1 μL ve DTT 1 μL 1 μL o tüp için ekleyin.Not: Bu kimyasalların bir enzimatik teşkil photobleaching kaldırarak azaltır antifade kokteyl21 çözünmüş oksijen ve şoklama reaktif radikallerin. Bu photobleaching ve Mikrotubul dağılma uyarma aydınlatma floresans22,23görüntüleme sırasında neden azaltır. ATP konsantrasyonu 1 mM daha önemli ölçüde daha düşük olması için seçilen deneyler için aşağıdaki reaktifler bir ATP rejenere sistemi oluşturmak için ekleyin: 1 μL bölünmemeli kreatin fosfat çözüm ve bölünmemeli kreatin 1 μL fosfokinaz çözüm. Hisse senedi ATP çözeltinin 1 μL hareketliliği ekleyin. Flick veya girdap rastlanılmaması kimyasallar dağıtmak için aliquot.Not: Böylece, kimyasallar çözüm son konsantrasyonu vardır 10 mikron paklitaksel, 0.5 mg·mL– 1 kazein, 20 mM D-glikoz, 200 μg·mL– 1 glikoz oksidaz, 8 μg·mL– 1 katalaz, 10 mM dithiothreitol, 2 mM kreatin fosfat (Eğer), 2 units· (Eğer) L– 1 kreatin fosfokinaz ve 1 mM ATP. Bu çözüm bundan sonra hareketliliği çözüm olarak sevk edilecek. KinesinNot: Bu deneylerde kullanılan hisse senedi kinesin çözüm için entegre Nanoteknolojide Sandia Ulusal laboratuvarları, G. Bachand Merkezi tarafından hazırlanan ve Kullanıcı Sözleşmesi (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php) kapsamında sunulan. burada kullanılan arabellek 40 mM imidazole, 300 mM NaCl, 0,76 g· oluşur. L-1 EGTA, 37,2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 sükroz, 0.2 mM TCEP ve 50 mikron Mg-ATP. Deneyler için bu dizi rkin430eGFP kinesin yapı kullanılmıştır. İlk 430 amino asitler sıçan kinesin ağır zincir eGFP ve bir C-terminal O’nun etiketi kuyruk etki alanı24erimiş oluşan bir kinesin bu. Escherichia coli ifade edildi ve Ni−NTA sütun kullanarak saf. GFP kinesin hisse senedi çözüm konsantrasyonu 1.8 ± 0,3 mikron UV/Vis spectrophotometry, GFP 489 nm25, 55 mM-1·cm-1 için bir yok olma katsayısı kullanarak tarafından belirlenen ve o kinesin dikkate alarak bir dimer. Deney için istenen kinesin konsantrasyon veya yüzey yoğunluğu belirlemek. Tipik deneyleri için bu 20 bölgedir nM. Kinesin konsantrasyon seyreltilmiş gerekiyorsa daha–dan a hundred-fold, kazein, 0.5 mg·mL-1 içeren BRB80 bir çözümde oranında seyreltin. Kinesin çözüm 1 µL hareketliliği için son bir konsantrasyon approximatively 20 almak ekleyin nM. Mikrotübüller 10 μL bölümünde 1,3 hareketliliği çözüm için hazırlanan MT100 çözüm ekleyin.Not: Bu hareketliliği çözüm ilâ 3 saat için kullanılabilir. Çözüm glikoz enzimatik reaksiyon tarafından tüketilmiş çünkü bu saatten sonra antifade sistem etkinliğini kaybeder. 2. montaj akışı hücreleri Coverslips yıkama Akış hücreler için büyük bir coverslip kullanın (Boyut: 60 x 25 mm) ve küçük bir (Boyutlar: 22 x 22 mm)19. Tüm coverslips etanol ile iki kez ve iki kez Ultrasaf Su ile durulayın. 5 dk. kuru için onları 50-75 ° c ısıda bir fırında coverslips Ultrasaf Su solüsyon içeren temizleyicide Bir UV/ozon temizleyici kullanarak ( Tablo malzeme ve üretici yönergelerine bakın), 15 dk. Bu adım gerçekleştirmek için her coverslip bir tarafı (~ 25 ° C) Oda sıcaklığında ve normal atmosferik durum tedavi (basınç 1 atm). Dikkatle her coverslip (Cımbız kullanarak), diğer tarafa açın ve UV/ozon tedavi de şu tarafa. Onları tekrar kurutma önce bir sıcaklık 50-75 ° c fırında 5 min için tekrar Ultrasaf Su coverslips solüsyon içeren temizleyicide PEG-PPG-PEG kaplama etkinleştirmek için coverslips tedaviNot: Dimethyldichlorosilane ve yüksek derecede toksik varlık protokolü bu bölümünde kullanılan Toluen gerçekleştirmek bir duman başlık altında aşağıdaki adımları aşağıdaki önlemleri alarak: iki kümesi koruyucu eldiven ve onların laboratuarına altında bir uzun kollu gömlek giymek kat. Böylece deri ön kolda üzerinden doğrudan bir dökülme durumunda kimyasallara maruz eldiven kollu gömlek içinde kenarlarını sok. Koruyucu gözlük. 25 mL Toluen 475 ml saf dimethyldichlorosilane oranında seyreltin. Her coverslip dimethyldichlorosilane ve Toluen çözüm 15 saniye boyunca bırakın. Coverslips iki kez Toluen ve üç kere metanol yıkayın. Basınçlı azot kullanarak coverslips kuru. Coverslips akışı hücrelere montaj Coverslips kuru olduğunda, Çift taraflı bant 2 cm x 2,5 cm parçası dikey olarak iki 1 cm x 2,5 cm şeritler kesin. Büyük coverslip hassas görev silecek üzerinde koymak ve teyp çizgili teyp parçaları arasında 1 cm x 2,5 cm alan oluşturmak için coverslip kenarları boyunca boyuna sopa. Küçük coverslip akışı hücre derleme bitirmek için teyp çizgiler üzerine sopa. 3. akan çözümler akış hücre Approximatively 20 μL PEG-PPG-PEG çözüm monte akışı hücre akışı. Hücrede uçakla birim odası doldurmak için yeterli büyüklükte olması gerekiyor. Sonraki adımda ne zaman çözümleri alışverişi aynı birim kullanın. 5 dakika boyunca yüzeyde emmek PEG-PPG-PEG çözüm sağlar. BRB80 arabellek PEG-PPG-PEG çözümle arabellekte akan tarafından 3 kez değişimi. Motilite çözüm akışı hücreye akışı. Planlanan deney bir saatten uzun olduğunda buharlaşma önlemek için yağ ile akış hücre kenarlarını kapatın.Not: Akış hücre şimdi yansıması hazırdır. 4. bir akış hücre görüntüleme Mikrotübüller ve ( Tablo malzemelerigörmek) kinesin motorlar için bir amaç-türü toplam iç yansıma Floresan (TIRF) kurulumu kullanarak görüntüleme gerçekleştirmek.Not: Burada, biz bir mikroskop ile 100 x kullanılan / 1,49 sayısal diyafram objektif lens, bir dalga boyu 642 ile iki lazerler kullanarak nm ve maksimum güç 140 mW ve bir dalga boyu 488 nm ve maksimum güç 150 mW. Bir damla daldırma yağı hedefte yerleştirin. Mikroskop platformunda akış yerleştirin ve kadar amacı yağlıboya ve akış hücre arasında temas amacı getir. Mikroskop’ın interlok kapak sistemi kaçan tüm Lazer ışığı engellemek için kullanın. Üzerine lazer açmak ve akış hücre alt yüzeyinde odaklan. Mikrotübüller fluorescently etiketli ve dalga boyu 647 heyecanlı nm. 488 nm lazer GFP kinesin motorlar için kullanıldığı gibi bir 642 nm lazer kullanarak yansıma. Görüntüleri veya videoları ilgi kaydedin. Tipik olarak, lazer güçtür yaklaşık 30 / mW ve 50 ms her ikisi için bir çekim hızı lazer kanalları. Orada olduğu sürece hareket akışı hücrede görüntüler için kaydedilebilir.Not: Lazer aydınlatma için çıplak gözle zararlıdır ve onarılamaz hasara neden olabilir. Işıklı alan tamamen opak bir kapak ile örtülü dikkat edin.