Montagem Molecular vaivéns alimentados por reversivelmente ligado Kinesins

1. preparação da solução Atenção: Três dos reagentes usados no presente protocolo (tolueno, dimetildiclorossilano e ditiotreitol) são altamente tóxicos. Por favor, consulte as fichas de dados de segurança relevantes (MSDS) antes do uso. Além disso, as partes do presente protocolo precisam ser executada sob um maior nível de proteção, usando óculos de segurança e dois pares de luvas de protecção conforme indicado. A menos que caso contrário aconselhou, as experiências podem ser executadas em bancadas de laboratório durante o uso de todo o equipamento de protecção adequado (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça comprida e sapatos fechados). Nota: As concentrações do ATP, cinesina e microtúbulos que são utilizados no presente protocolo podem ser modificadas tendo em conta as necessidades de cada experimento. No entanto, se modificado, por favor, certifique-se que as concentrações finais dos outros reagentes permanecem os mesmos como dado abaixo. Todos os experimentos foram realizados em temperatura ambiente, (~ 25 ° C). Preparação das soluções estoqueNota: Preparar e alíquota as seguintes soluções de antemão. Todas as alíquotas podem ser preparadas à temperatura ambiente (~ 25 ° C). Buffer de BRB80Nota: A reserva para a maioria das soluções utilizadas neste protocolo é BRB80. BRB80 pode ser preparado em grandes quantidades e armazenado em um freezer-20 ° C. Dissolver 24,2 g de piperazina-N, n-bis(2-ethanesulfonic acid) (tubos) e 3,1 g de hidróxido de potássio (KOH) em 800 mL de água desionizada para fazer 800 mL de tubos de 100 mM. Adicione 100 mL de 10 mM de cloreto de magnésio (MgCl2) e 100 mL de ácido de 10mm etilenoglicol etilenodiaminotetracético (EGTA) para obter um volume final de 1 L. elevando o pH a 8 com hidróxido de potássio (KOH) pode ajudar na dissolução dos tubos e EGTA.Nota: As concentrações finais dos produtos químicos no buffer BRB80 são tubos de 80 mM, 1 mM MgCl2e 1 mM EGTA. Ajuste o pH da reserva para 6,9 usando KOH e ácido clorídrico (HCl). ATP Prepare uma solução de 1 mL de 100mm ATP em água ultrapura. A solução em 10 alíquotas μL de pipeta. Armazene as alíquotas em um freezer-80 ° C. GTP Prepare uma solução μL 500 de 25mm GTP em água ultrapura. A solução em 5 alíquotas μL de pipeta. Armazene as alíquotas em um freezer-80 ° C. MgCl2 Prepare uma solução de 1 mL de 100 mM MgCl2 em água ultrapura. A solução em 10 alíquotas μL de pipeta. Armazene as alíquotas em um congelador-20 ° C. Caseína Pesar 1 g de caseína seca e transferir para um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Adicione 35 mL de tampão de BRB80 para o tubo para dissolver o pó de caseína. Coloque a solução em um copo em uma sala fria a dissolver-se durante a noite. Neste ponto, a solução ficará espesso e viscoso. Deixe o tubo na posição vertical em uma geladeira de 4 ° C para permitir qualquer grandes aglomerações não dissolvidas resolver. Transferi o sobrenadante para um tubo novo. Gire o tubo em uma centrífuga a 1.000 x g a pelota para fora mais precipitados. Mais uma vez, transferi o sobrenadante para um tubo novo. Repetidamente, filtre a solução usando filtros de 0,2 μm (7 bar pressão máxima). A solução a ser grosso, muitos filtros vão entupir, Então repita este passo até que o filtro é claro e desentupi. Determine a concentração de caseína na solução resultante utilizando espectrofotometria UV/Vis, usando o coeficiente de extinção da caseína de 19 mM-1∙cm-1 a 280 nm20. Assumindo um peso molecular de 23 kDa para caseína, dilua a solução com uma concentração de 20 mg∙mL-1 em BRB80. A solução em 20 alíquotas μL de pipeta e armazenar as alíquotas em um congelador-20 ° C. D-glicose Prepare uma solução de 1 mL de 2 M-D-glicose em água ultrapura. A solução em 10 alíquotas μL de pipeta. Armazene as alíquotas em um congelador-20 ° C. Glicose oxidase Prepare uma solução de 1 mL de 20 mg∙mL-1 glicose oxidase em BRB80. A solução em 10 alíquotas μL de pipeta. Armazene as alíquotas em um congelador-20 ° C. Catalase Prepare uma solução de 1 mL de 0,8 mg∙mL-1 catalase em BRB80. A solução em 10 alíquotas μL de pipeta. Armazene as alíquotas em um congelador-20 ° C. Ditiotreitol (DTT)Nota: Desde que a TDT é ligeiramente voláteis e tóxicos, por favor, realize as seguintes etapas sob uma coifa. Prepare uma solução de 1 mL de 1 M DTT diluído em água ultrapura. A solução em 10 alíquotas μL de pipeta. Armazene as alíquotas em um congelador-20 ° C. Paclitaxel Prepare uma solução de 1 mL de 1 mM paclitaxel diluído em DMSO. A solução em 10 alíquotas μL de pipeta. Armazene as alíquotas em um congelador-20 ° C. Dimetilsulfóxido (DMSO)Nota: O DMSO usado nesses experimentos é puro. Pipetar 1 mL de DMSO puro em 10 alíquotas μL. Armazene as alíquotas em um congelador-20 ° C. Fosfato de creatina Prepare uma solução de 1 mL de 0,2 M de fosfato de creatina em água ultrapura. A solução em 10 alíquotas μL de pipeta. Armazene as alíquotas em um congelador-20 ° C. Creatina fosfoquinase Preparar uma solução de 1 mL de 200 units· L-1 creatina fosfoquinase em água ultrapura. A solução em 10 alíquotas μL de pipeta. Armazene as alíquotas em um congelador-20 ° C. Sulfato de níquel (II) Prepare 500 mL de uma solução de sulfato de níquel (II) de 50 mM em água ultrapura. Armazene a solução à temperatura ambiente (~ 25 ° C). Poly(Ethylene glycol)-bloco-poly(propylene glycol)-bloco-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) solução Pesar 2 mg de PEG-PPG-PEG (número peso molecular médio: 14.600 g∙mol-1)-pó NTA no papel de pesagem. PEG-PPG-PEG-NTA é o copolímero tribloco acrescido com um grupo de (NTA) ácido nitrilotriacético. Consulte a Tabela de materiais para mais detalhes sobre o PEG-PPG-PEG-NTA. Transferi o pó em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Adicione 1 mL da solução de sulfato de níquel (II) ao tubo. Vórtice até que o pó é dissolvido e não aglomerados visíveis permanecem. Armazenamento para até um mês em temperatura ambiente. Antes de iniciar um experimento Encha um balde com gelo. Tomar uma alíquota de cada um dos 13 reagentes descritos nas seções 1.1.1 para 1.1.13 acima e adicioná-los para o balde, assim, mantê-los no gelo. Descongele a cada um dos reagentes antes de usar. Preparação do microtubuleNota: Os microtúbulos foram polimerizados de uma alíquota de 20 μg de tubulina liofilizada tingir-etiquetados. O comprimento de onda de excitação da tintura é de 647 nm. Preparação do buffer microtubule crescimento Pipeta 21,8 μL de tampão de BRB80 em microcentrifuga pequeno (0,6 mL) do tubo. Adicione 1 μL da solução-mãe MgCl2 , 1 μL da solução-mãe GTP e 1,2 μL da solução-mãe DMSO.Nota: Assim, as concentrações finais dos reagentes no buffer BRB80 são 4 mM MgCl2, 1mm GTP e dimetilsulfóxido 5% (v/v). Polimerização de microtúbulos Adicione 6,25 μL de tampão de crescimento do microtúbulo diretamente em uma alíquota de 20 μg de tubulina liofilizada rotulada. Vórtice da alíquota para 5 s em 30 rps. Arrefecer a alíquota no gelo por 5 min antes a incubar a 37 ° C por 45 min e prossiga para a seção 1.3.3. Estabilização do microtubule Adicione 5 μL da solução de paclitaxel aliquotadas para 490 μL de tampão de BRB80. Vórtice a solução por 10 s em 30 rps. Uma vez que a 45 min de incubação para os microtúbulos estão acima, adicione 5 μL da solução microtubule polimerizado para a solução de BRB80/paclitaxel.Nota: Esta solução de 100 vezes do microtubule diluído, estabilizada, será doravante referida como MT100. Ele pode ser usado por até 5 dias, e ele pode ser diluído para obter a densidade desejada microtubule para cada experimento. Solução de mobilidade Media enzimática e sistema de regeneração de ATP ATP Adicione 9.0 μL da solução de caseína aliquotadas para 291 μL de tampão de BRB80. Se a concentração de ATP desejada para o experimento é inferior a 1 mM, pipetar 83 μL da solução de caseína/BRB80 para um novo tubo de microcentrifuga de 0,6 mL. Caso contrário, pipetar 85 μL dessa solução para um novo tubo de microcentrifuga de 0,6 mL. Adicione 1 μL de D-glicose, 1 μL de glicose oxidase, 1 μL de catalase e 1 μL de TDT para esse tubo.Nota: Estes produtos químicos constituem um enzimático antidesgaste coquetel21 que irá reduzir o fotobranqueamento removendo dissolvido radicais reativos de oxigênio e têmpera. Isso reduz o fotobranqueamento e microtubule desintegração causada pela iluminação da excitação durante a fluorescência de imagem22,23. Para experiências em que a concentração de ATP é escolhida para ser significativamente inferior a 1 mM, adicionar os seguintes reagentes a solução para criar um sistema de regeneração de ATP: 1 μL de solução de fosfato de creatina aliquotadas e 1 μL da creatina aliquotada fosfoquinase solução. Adicione 1 μL da solução ATP para a solução de mobilidade. Súbito ou vórtice alíquota homogênea, distribuir os produtos químicos.Nota: Assim, a concentração final de produtos químicos na solução são 10 μM paclitaxel, 0,5 mg·mL− 1 caseína, 20 mM D-glicose, 200 μg·mL− 1 glicose oxidase, 8 μg·mL− 1 da catalase, ditiotreitol 10 mM, 2 mM fosfato de creatina (se adicionados), 2 Units· L− 1 creatina fosfoquinase (se adicionado) e 1 mM de ATP. Esta solução será daqui em diante referida como a solução de mobilidade. CinesinaNota: A solução de estoque cinesina usada nesses experimentos é preparada pela G. Bachand no centro para nanotecnologias integradas no Sandia National Laboratories e disponibilizada sob um contrato de usuário (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). O buffer usado aqui consiste de imidazol 40 mM, 300 mM de NaCl, 0.76 g · L-1 EGTA, 37,2 mg· L-1 EDTA, 50 g · L-1 sacarose, 0,2 mM TCEP e 50 μM Mg-ATP. Para esta série de experimentos, utilizou-se a construção da cinesina rkin430eGFP. Esta é uma cinesina, consistindo o primeiro 430 aminoácidos da cadeia pesada de cinesina de rato fundido a eGFP e um C-terminal His-tag na cauda domínio24. Ele foi expressa em Escherichia coli e purified usando uma coluna de Ni−NTA. A concentração da solução-mãe GFP-cinesina foi de 1,8 ± 0,3 μM, conforme determinado por espectrofotometria UV/Vis, utilizando um coeficiente de extinção para GFP de 55mm-1·cm-1 às 489 nm25, e tendo em conta que a cinesina é um dímero. Determine a densidade de concentração ou superfície cinesina desejado para o experimento. Para ensaios típicos, esta concentração é de 20 nM. Se a concentração de cinesina precisa ser diluído mais de cem vezes mais, diluí-la em uma solução de BRB80 que contém mg·mL 0,5-1 da caseína. Adicionar 1 µ l de solução cinesina para a solução de mobilidade para obter uma concentração final de aproximadamente 20 nM. Microtúbulos Adicione 10 μL da solução MT100 preparada na seção 1.3 para a solução de mobilidade.Nota: Esta solução de mobilidade pode ser usada por até 3 horas. Após esse tempo, o sistema antidesgaste perde sua eficácia porque a glicose na solução está esgotada pela reação enzimática. 2. montagem das células de fluxo Lavar as lamínulas Para células de fluxo, use uma grande lamela (dimensão: 60 x 25 mm) e um pequeno (dimensões: 22 x 22 mm)19. Lave todas as lamelas duas vezes com etanol e duas vezes com água ultrapura. Proceda à sonicação as lamelas em água ultrapura para 5 min. seque-os em um forno a uma temperatura de 50-75 ° C. Usando um UV/ozônio limpa (ver Tabela de materiais e as instruções do fabricante), tratar um lado de cada lamela durante 15 min. executar este passo pode, à temperatura ambiente (~ 25 ° C) e em condições atmosféricas normais (pressão de 1 atm). Vire cuidadosamente cada lamela para seu outro lado (usando uma pinça) e UV/ozônio tratar esse lado também. Proceda à sonicação as lamelas em água ultrapura novamente por 5 min antes da secagem-los novamente no forno a uma temperatura de 50-75 ° C. Tratando as lamelas para habilitar PEG PEG-PPG revestimentoNota: O dimetildiclorossilano e o tolueno usado nesta parte do protocolo sendo altamente tóxico, execute as seguintes etapas sob uma coifa, ao tomar as seguintes precauções: usar dois pares de luvas de protecção e uma camisa de manga comprida, em seu laboratório casaco. Dobre as bordas das luvas dentro as mangas da camisa para que sem pele do antebraço é diretamente exposto aos produtos químicos no caso de um derrame. Use óculos de protecção. Dilua 25 mL de puro dimetildiclorossilano em 475 mL de tolueno. Mergulhe cada lamela na solução dimetildiclorossilano e tolueno durante 15 segundos. Lave as lamínulas duas vezes em tolueno e três vezes em metanol. Seque as lamelas usando nitrogênio pressurizado. As lamelas de montagem em células de fluxo Uma vez que as lamelas são secas, corte um pedaço de 2 x 2,5 cm de fita dupla-face verticalmente em listras de duas 1 x 2,5 cm. Ponha a lamela grande um limpador de tarefa delicada e fique nas listras de fita longitudinalmente ao longo das bordas da lamela para criar uma área de 1 x 2,5 cm entre os pedaços de fita. Vara pequena lamela em cima das listras de fita para terminar a montagem de célula de fluxo. 3. fluxo das soluções em uma célula de fluxo Fluxo de cerca de 20 μL da solução de PEG-PPG-PEG dentro da célula de fluxo montado. O volume que voou na célula deve ser grande o suficiente para encher a câmara. Nas próximas etapas, use o mesmo volume ao trocar as soluções. Permitem a solução de PEG-PPG-PEG absorver na superfície por 5 minutos. Troca a solução de PEG-PPG-PEG com buffer BRB80 3 vezes pelo fluxo de buffer em. Flua a solução de mobilidade para a célula de fluxo. Sele as bordas da célula de fluxo com graxa para evitar a evaporação, se o experimento planejado é mais de uma hora.Nota: A célula de fluxo está agora pronta para ser fotografada. 4. imagem de uma célula de fluxo Execute a imagem usando uma configuração de fluorescência (TIRF) objetivo-tipo de reflexão interna total para ambos os microtúbulos e os motores cinesina (ver Tabela de materiais).Nota: Aqui, nós usamos um microscópio com um x 100 / 1.49 lente objetiva de abertura numérica, usando dois lasers, um com um comprimento de onda de 642 nm e uma potência máxima de 140 mW e outro com comprimento de onda de 488 nm e uma potência máxima de 150 mW. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o objetivo. Coloque a pilha de fluxo na plataforma do microscópio e trazer o objectivo até há contato entre o óleo sobre o objectivo e a célula de fluxo. Use o sistema de cobertura do bloqueio do microscópio para bloquear toda a luz do laser escapem. Sobre o laser e focar-se na superfície inferior da célula de fluxo. Os microtúbulos fluorescente são rotulados e animados no comprimento de onda de 647 nm. Eles vão ser fotografados usando um laser de nm 642 enquanto um 488 nm do laser é usada para os motores de GFP-cinesina. Grave as imagens ou vídeos de interesse. Normalmente, a potência do laser é de cerca de 30 mW e um tempo de exposição de 50 ms para os dois canais de laser. Imagens podem ser gravadas por enquanto há motilidade na célula de fluxo.Nota: A iluminação laser é prejudicial para o olho nu e pode causar danos irreparáveis. Por favor, certifique-se que a área iluminada é completamente coberta com uma tampa opaca.