キネシンを添付可逆的アトス分子シャトルの組み立て

1. ソリューションの準備 注意: このプロトコル (トルエン、dimethyldichlorosilane、およびジチオトレイトール) に用いられる試薬の 3、猛毒です。使用前に製品安全データシート (MSDS) を参照してください。さらに、このプロトコルの部分は示されているように、保護メガネ ・保護手袋の 2 つのセットを着て保護の高いレベルで実行する必要があります。そうでなければお勧めしない限り、実験はすべて、適切な個人用保護具 (保護メガネ、手袋、白衣、フルの長さのズボン、閉じてつま先の靴) を使用している間実験室ベンチに実行できます。 注: ATP、キネシン、このプロトコルで使用されている微小管の濃度は、各実験の必要性を与えられて変更できます。ただし、変更した場合を確認してください指定されたと同じである他の試薬の最終濃度以下。すべての実験は、部屋の温度、(〜 25 ° C) で行われました。 ストック溶液の調製注: 準備と分注事前に以下のソリューション。すべての因数は、室温 (〜 25 ° C) で用意できます。 BRB80 バッファー注: このプロトコルで使用されるソリューションのほとんどのバッファーは、BRB80 です。BRB80 を大量に作成し、-20 ° C のフリーザーで保存されています。 24.2 g を溶解ピペラジン N, n ′-bis(2-ethanesulfonic acid) (パイプ) 800 mL の脱イオン水に水酸化カリウム (KOH) の 3.1 g の 100 mM のパイプの 800 mL を作るため。水酸化カリウム (KOH) と 8 の pH は、パイプおよびグリコールエーテルジアミン四酢酸の溶解の助けることができる 1 の l. 向上の最終的な容積を得るため 100 mL (MgCl2) 塩化マグネシウム 10 mM と 10 mM エチレング リコール四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸) の 100 mL を追加します。注: BRB80 バッファー中の化学物質の最終濃度は、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM MgCl2、80 mM のパイプです。 6.9 島と塩酸 (HCl) を使用して、バッファーの pH を調整します。 ATP 100 mM 超純水の ATP の 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-80 ° C のフリーザーに試料を保存します。 GTP 25 mM 超純水で GTP の 500 μ L 溶液を準備します。5 μ 因数にソリューションをピペットで移しなさい。-80 ° C のフリーザーに試料を保存します。 MgCl2 100 mm MgCl2純水 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。 カゼイン ドライ カゼインの 1 グラムの重量を量るし、50 mL の円錐形遠心管にそれを転送します。カゼインの粉末を溶解する管に 35 mL の BRB80 バッファーを追加します。 一晩溶解するため冷蔵室でタンブラーにソリューションを配置します。この時点で、ソリューションは、厚めで粘度になります。 チューブは解決する任意の大きな不溶の塊を許可する 4 ° C 冷蔵庫で直立のままにします。上清を新しいチューブに転送します。 多くの沈殿物をペレットに 1,000 × gで遠心分離の管をスピンします。もう一度、上清を新しいチューブに転送します。 繰り返し 0.2 μ m (最大圧力バー 7) フィルターを使用して、ソリューションをフィルター処理します。厚いソリューション、多くのフィルターが詰まるのでフィルターがクリアされるまで、この手順を繰り返します、unclogged になります。 紫外・可視吸光光度法、280 nm2019 mM-1∙cm-1のカゼインの消散係数を使用してを使用して得られた溶液でカゼイン濃度を決定します。カゼインの 23 kDa の分子量を仮定すると、希釈濃度 BRB80 で 20 mg∙mL-1のソリューションです。 ピペット 20 μ 因数にソリューションし、-20 ° C のフリーザーに因数を格納します。 D-グルコース 純水で 2 M D-グルコースの 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。 グルコースオキシダーゼ BRB80 で 20 mg∙mL-1グルコースオキシダーゼの 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。 カタラーゼ BRB80 で 0.8 mg∙mL-1カタラーゼの 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。 ジチオトレイトール (DTT)注: DTT はわずかに揮発性、毒性、ヒューム フードの下で次の手順を実行してください。 1 M 超純水で希釈した DTT の 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。 パクリタ キセル DMSO で希釈し 1 mM パクリタ キセルの 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。 ジメチルスルホキシド (DMSO)注: これらの実験で使用される DMSO は純粋です。 10 μ L の因数に純粋な DMSO の 1 mL をピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。 クレアチンリン酸 純水で 0.2 M クレアチンリン酸の 1 mL の溶液を準備します。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。 クレアチンホスホキナーゼ 200 units· の 1 mL の溶液を準備します。L-1クレアチンホスホキナーゼ純水。10 μ L の因数にソリューションをピペットで移しなさい。-20 ° C のフリーザーに試料を保存します。 硫酸ニッケル (II) 純水で 50 mM ニッケル (II) の硫酸塩の溶液 500 mL を準備します。室温 (〜 25 ° C) でソリューションを保存します。 Poly(ethylene glycol)-ブロック-poly(propylene glycol)-ブロック-poly(ethylene glycol) (ペグ-PPG-PEG) ソリューション ペグ PPG ペグ 2 mg を量り (数平均分子量: 14,600 g∙mol-1)-紙の重さの NTA パウダー。ペグ-PPG-ペグ-国税庁は、修飾とニトリロ三酸 (NTA) グループ トリブロック共重合体です。ペグ PPG ペグ NTA の詳細について材料表を参照してください。 1.5 mL 遠心チューブに粉を転送します。チューブにストックのニッケル (II) の硫酸塩の溶液の 1 mL を追加します。粉末を溶解するまで渦とない目に見える塊のままです。 室温で 1 ヶ月までのストア。 実験を開始する前に 氷とバケツを埋めます。 1.1.1 に 1.1.13 上記のセクションで説明されている 13 の試薬のそれぞれから 1 つの因数を取るし、氷の上それらをようにバケツにそれらを追加します。使用前に試薬のそれぞれを解凍します。 微小管の準備注: 微小管が凍結乾燥チューブリンの色素標識の 20 μ g 因数から重合します。色素の励起波長は 647 nm。 微小管の成長バッファーの準備 ピペット 21.8 μ BRB80 のバッファー (0.6 ml) 遠心チューブします。MgCl2原液 1 μ、GTP のストック溶液 1 μ L と DMSO の原液の 1.2 μ L を追加します。注: したがって、BRB80 バッファー試薬の最終濃度は 5% (v/v) ジメチルスルホキシド、1 mM GTP、4 mM MgCl2。 微小管重合 ラベル付けされた凍結乾燥チューブリンの 20 μ g 因数に直接微小管の成長バッファーの 6.25 μ L を追加します。渦 5 因数 30 rps で s。 45 分の 37 ° C で培養する前に 5 分間氷上因数を冷却し、1.3.3 をセクションに進みます。 微小管の安定化 BRB80 バッファーの 490 μ L に検体パクリタ キセル溶液の 5 μ L を追加します。渦 10 ソリューション 30 rps で s。 微小管のインキュベーションの 45 分がアップされたら、微小管重合溶液 5 μ L を BRB80/パクリタ キセルのソリューションに追加します。注: MT100 として、この 100 希釈、安定化、微小管ソリューションを指す以下でしょう。5 日間使用することができます、各実験に必要な微小管密度を得るため希釈することができます。 運動ソリューション ATP、ATP の再生システム、酵素 antifade BRB80 バッファーの 291 μ L に検体カゼイン溶液の 9.0 μ L を追加します。 場合は実験に必要な ATP 濃度は 1 mM、新しい 0.6 mL 遠心チューブに BRB80/カゼイン溶液のピペット 83 μ L より低い。それ以外の場合、新しい 0.6 mL 遠心チューブにソリューション ピペット 85 μ。 そのチューブに D-グルコース、グルコース酸化酵素の 1 μ L、カタラーゼ活性の 1 μ L、DTT の 1 μ L の 1 μ L を追加します。注: これらの化学物質、酵素を構成する削除することによって退色を軽減する antifade のカクテル21溶存酸素と消炎反応性ラジカル。これは、蛍光イメージング-2223中に励起光による退色と微小管の崩壊を軽減されます。 実験 ATP 濃度が 1 mM 未満大幅に選択されます、次の試薬を ATP 生成システムを作成するソリューションに追加: 検体のクレアチン燐酸液と検体のクレアチンの 1 μ L の 1 μ Lクレアチンホスホキナーゼ ソリューションです。 運動ソリューションに ATP 原液 1 μ L を追加します。フリックまたは渦流既存化学物質を配布する因数。注: したがって、最終的なソリューション中の化学物質濃度が 10 μ M のパクリタ キセル、0.5 mg·mL− 1カゼイン、20 mM D-グルコース、200 μg·mL− 1グルコースオキシダーゼ、8 μg·mL− 1カタラーゼ、ジチオトレイトール 10 mM、2 mM クレアチンリン酸 (追加), 2units·L− 1クレアチンホスホキナーゼ (追加) の場合、1 mM ATP.このソリューションに運動ソリューションとして以下が。 キネシン注: これらの実験で使用される在庫キネシン ソリューションはサンディア国立研究所統合ナノテクノロジー センターで g さんとで調製した、ユーザー契約 (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php) の下で利用できるようにしますここで使用されるバッファーは 40 mM のイミダゾール、300 mM の NaCl、0.76 g·。L-1 37.2 mg· グリコールエーテルジアミン四酢酸L-1 EDTA、50 g·50 μ M、0.2 mM TCEP、L-1ショ糖 Mg ATP。この一連の実験では、rkin430eGFP のキネシンの構造体が使用されました。これは eGFP と尾ドメイン24C ターミナル彼-タグ融合したラット キネシン重鎖の最初 430 のアミノ酸から成るキネシンです。それは大腸菌で発現させた、Ni−NTA 列を使用して浄化します。GFP キネシンの原液の濃度は 1.8 ± 0.3 μ M 紫外・可視吸光光度法、489 nm25、55 ミリメートル-1·cm-1の GFP の消散係数を使用してによって決定されるとそのキネシンを考慮して含まれています。 実験の目的キネシン濃度または表面密度を決定します。この濃度は、典型的な試金、20 nM。キネシン濃度を希釈する必要がある場合よりも 100 倍、0.5 mg·mL-1のカゼインが含まれている BRB80 の溶液で希釈しています。 Approximatively 20 の最終濃度を得るために運動ソリューションにキネシン溶液 1 μ L を追加 nM。 微小管 運動ソリューションのセクション 1.3 で、MT100 溶液 10 μ L を追加します。注: この運動ソリューションは、最大 3 時間使用できます。その後、antifade システムは、ソリューション内のブドウ糖は酵素反応によって使い果たされたためその効果を失います。 2. フロー セルの組み立てください。 洗浄、coverslips フロー セル使用大きい coverslip (ディメンション: 60 mm × 25 mm) と小さいの (寸法: 22 mm × 22 mm)19。 すべて coverslips エタノールで 2 回と超純水で 2 回洗浄します。5 分は 50-75 ° C の温度のオーブンでそれらを乾燥するために純水 coverslips を超音波照射します。 クリーナー UV/オゾンを用いた (表の材料と製造元の指示を参照)、室温 (〜 25 ° C) で、通常の大気条件で 15 分この手順が実行する各 coverslip の片側を治療 (1 の圧力 atm)。 慎重に各 coverslip (ピンセットを使用して) その他の側に、UV/オゾン治療側も。 50-75 ° C の温度のオーブンでそれらを再度乾燥する前に 5 分間再び純水 coverslips を超音波照射します。 ペグ PPG ペグ コーティングを有効に coverslips の治療注: dimethyldichlorosilane と非常に有毒なされているプロトコルのこの部分で使用されるトルエンは次の予防策を取っている間ヒューム フードの下で次の手順を実行: 2 組の手袋および彼らの実験室の下に長袖シャツを着用コート。腕の皮膚は、流出の場合化学物質に直接公開ないので、シャツの袖の内側の手袋の端を押し込みます。保護メガネを着用します。 475 ml のトルエンの純粋な dimethyldichlorosilane の 25 mL を希釈します。15 秒間 dimethyldichlorosilane とトルエン溶液にそれぞれ coverslip を浸します。 メタノール トルエンで 2 回、3 回、coverslips を洗います。加圧窒素を用いて coverslips を乾燥させます。 フローセルに coverslips を組み立てる 一度、coverslips が乾燥、2 1 × 2.5 cm の縞模様に垂直に両面テープの 2 × 2.5 cm 部分をカットします。 繊細なタスク ワイパーに大きな coverslip を置いてテープ ストライプをテープの部分の間 1 cm × 2.5 cm の領域を作成する coverslip のエッジに沿って縦にスティックします。 フロー ・ セル ・ アセンブリを完了するテープ ストライプの上に小さな coverslip を棒します。 3. フローセルにソリューションの流れ ペグ PPG PEG 溶液 20 μ L approximatively を組み立てフロー ・ セルに流れ込みます。セルで飛行はボリュームは、部屋を満たす十分な大きさでなければなりません。次の手順では、ソリューションを交換するとき同じボリュームを使用します。 5 分の表面に吸収するペグ PPG-止め釘の解決を可能にします。Exchange BRB80 バッファーとペグ PPG ペグ ソリューションでバッファーを流れることによって 3 回。運動ソリューションをフローセルに流れ込みます。 計画の実験の時間よりも長い場合、蒸発を防ぐためにグリースのフロー ・ セルのエッジをシールします。メモ: フロー ・ セルはイメージを作成する準備ができました。 4. 流れ細胞のイメージング 微小管、キネシン (材料の表を参照してください)、目的型全反射蛍光 (TIRF) のセットアップを使用してイメージングを実行します。注意: ここを使用して顕微鏡 100 倍で 1.49/開口数の対物レンズ、642 の波長 1 つ 2 つのレーザーを使用して nm と最大出力 140 mW、および 488 の波長別 nm、最高出力 150 mW。 目的浸漬オイルの滴を配置します。 顕微鏡プラットフォームへのフロー ・ セルの配置し、目的のオイルとフロー ・ セル間の接触があるまで目的をもたらします。 顕微鏡のインター ロック カバー システムを使用して、エスケープからすべてのレーザ光をブロックします。 レーザーをオンにし、流体セルの下の面に焦点を当てます。微小管は蛍光標識し、647 の波長で励起 nm。彼らは、GFP キネシン モーターの 488 nm レーザーが使用されている間 642 nm レーザーを使ってイメージ化されるでしょう。 興味のある動画や画像を記録します。通常、レーザー出力は約 30 mW と 50 ms の両方のための露光時間レーザー チャンネル。フロー ・ セルに運動性がある限りの画像を記録できます。注: レーザー照射は肉眼に目に有害な取り返しのつかない損傷を引き起こすことができます。照射領域が不透明な蓋で完全に覆われていることを確認してください。