Assemblaggio molecolare navette arricchite reversibilmente attaccato Kinesins

1. preparazione soluzione Attenzione: Tre dei reagenti utilizzati in questo protocollo (toluene, dimetildiclorosilano e dithiothreitol) sono altamente tossici. Si prega di consultare le schede di sicurezza materiale (MSDS) prima dell’uso. Inoltre, parti del presente protocollo devono essere eseguite nell’ambito di un più elevato livello di protezione, indossare occhiali di sicurezza e due set di guanti protettivi, come indicato. Salvo diverso avviso, gli esperimenti possono essere condotti su banchi di laboratorio durante l’utilizzo di tutti gli appropriati dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, camice da laboratorio, pieno lunghezza pantaloni e scarpe chiuse). Nota: Le concentrazioni del ATP, chinesina e microtubuli che vengono utilizzati nel presente protocollo possono essere modificate dato le esigenze di ogni esperimento. Tuttavia, se modificato, assicurarsi che le concentrazioni finali di altri reagenti rimangono le stesse come indicato qui sotto. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti a temperatura ambiente, (~ 25 ° C). Preparazione delle soluzioni madriNota: Preparare e aliquota le seguenti soluzioni in anticipo. Tutte le aliquote possono essere preparate a temperatura ambiente (~ 25 ° C). BRB80 tamponeNota: Il buffer per la maggior parte delle soluzioni utilizzate in questo protocollo è BRB80. BRB80 può essere preparato in grandi quantità e conservati in un congelatore a-20 ° C. Sciogliere 24,2 g di piperazina-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (tubi) e 3,1 g di idrossido di potassio (KOH) in 800 mL di acqua deionizzata per fare 800 mL di tubi 100 mM. Aggiungere 100 mL di 10 mM di cloruro di magnesio (MgCl2) e 100 mL di acido etilendiamminotetraacetico di 10mm glicole etilenico (EGTA) per ottenere un volume finale di 1 L. elevando il pH a 8 con idrossido di potassio (KOH) può aiutare nella dissoluzione dei tubi ed EGTA.Nota: Le concentrazioni finali dei prodotti chimici nel buffer BRB80 sono tubi da 80 mM, 1 mM MgCl2e 1 mM EGTA. Regolare il pH del buffer a 6,9 utilizzando KOH e acido cloridrico (HCl). ATP Preparare una soluzione di 1 mL di 100mm ATP in acqua ultrapura. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-80 ° C. GTP Preparare una soluzione di 500 μL di 25mm GTP in acqua ultrapura. Dispensare la soluzione in 5 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-80 ° C. MgCl2 Preparare una soluzione di 1 mL di 100 mM MgCl2 in acqua ultrapura. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Caseina Pesare 1 g di secco caseina e trasferirlo in una provetta conica per centrifuga da 50 mL. Aggiungere 35 mL di buffer di BRB80 al tubo per sciogliere la polvere di caseina. Posto la soluzione in un bicchiere in una cella frigorifera per sciogliere tutta la notte. A questo punto, la soluzione avrà un aspetto denso e viscoso. Lasciare il tubo in posizione verticale in un frigorifero a 4 ° C per consentire qualsiasi grandi ciuffi non disciolti a stabilirsi. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Girare il tubo in una centrifuga a 1.000 x g a pellet fuori più precipitati. Ancora una volta, trasferire il surnatante in una nuova provetta. Ripetutamente e filtrare la soluzione utilizzando 0,2 μm (7 bar di pressione massima) filtri. La soluzione essere di spessore, molti filtri saranno intasarsi, quindi ripetere questo passaggio fino a quando il filtro è chiaro e unclogged. Determinare la concentrazione di caseina nella soluzione risultante mediante spettrofotometria UV/Vis, utilizzando il coefficiente di estinzione di caseina di 19 mM-1∙cm-1 a 280 nm20. Assumendo un peso molecolare di 23 kDa per caseina, diluire la soluzione ad una concentrazione di 20 mg∙mL-1 in BRB80. Dispensare la soluzione in 20 aliquote del μL e conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. D-glucosio Preparare una soluzione di 1 mL di 2 M D-glucosio in acqua ultrapura. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Glucosio ossidasi Preparare una soluzione di 1 mL di 20 mg∙mL-1 glucosio ossidasi in BRB80. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Catalasi Preparare una soluzione di 1 mL di mg∙mL 0,8-1 catalasi in BRB80. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Ditiotreitolo (DTT)Nota: Poiché DTT è leggermente volatili e tossici, si prega di procedere come segue sotto cappa aspirante. Preparare una soluzione di 1 mL di 1 M DTT diluito in acqua ultrapura. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Paclitaxel Preparare una soluzione di 1 mL di paclitaxel 1mm diluito in DMSO. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Solfossido dimetilico (DMSO)Nota: Il DMSO utilizzato in questi esperimenti è puro. Pipettare 1 mL di DMSO puro in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Fosfato della creatina Preparare un 1 mL di soluzione del fosfato della creatina 0,2 M in acqua ultrapura. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Creatina fosfochinasi Preparare una soluzione di 1 mL di units· 200 L-1 del phosphokinase di creatina in acqua ultrapura. Dispensare la soluzione in 10 aliquote del μL. Conservare le aliquote in un congelatore a-20 ° C. Solfato di nichel (II) Preparare 500 mL di una soluzione di solfato di nichel (II) di 50 mM in acqua ultrapura. Conservare la soluzione a temperatura ambiente (~ 25 ° C). Poly(Ethylene Glycol)-blocco-poly(propylene glycol)-blocco-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) soluzione Pesare 2 mg di PEG-PPG-PEG (peso molecolare medio numerico: 14.600 g∙mol-1)-polvere NTA su carta di pesatura. PEG-PPG-PEG-NTA è il copolimero Triblocco funzionalizzato con un gruppo (NTA) acido nitrilotriacetico. Fare riferimento alla Tabella materiali per maggiori dettagli su PEG-PPG-PEG-NTA. Trasferire la polvere in una microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 1 mL di soluzione di solfato di nichel (II) riserva al tubo. Vortex fino a quando la polvere si è sciolta e non visibili grumi rimangono. Archivio per fino a un mese a temperatura ambiente. Prima di iniziare un esperimento Riempire un secchio di ghiaccio. Prendere un’aliquota da ciascuno dei 13 reagenti descritti nelle sezioni 1.1.1 a 1.1.13 sopra e aggiungerli al secchio, così mantenendoli su ghiaccio. Disgelo di ciascuno dei reagenti prima dell’uso. Preparazione dei microtubuliNota: I microtubuli sono stati polimerizzati da un’aliquota di 20 μg di tingere-contrassegnati liofilizzato tubulina. La lunghezza d’onda di eccitazione della tintura è di 647 nm. Preparazione del buffer crescita dei microtubuli Dispensare 21,8 μL di tampone di BRB80 in una microcentrifuga piccolo (0,6 mL) del tubo. Aggiungere 1 μL di soluzione di riserva di MgCl2 , 1 μL di soluzione di riserva GTP e 1,2 μL della soluzione madre di DMSO.Nota: Così, le concentrazioni finali dei reagenti nel buffer BRB80 sono 4 mM MgCl2, 1mm GTP e solfossido dimetilico 5% (v/v). Polimerizzazione dei microtubuli Aggiungere 6,25 μL di tampone di crescita dei microtubuli direttamente in un’aliquota di 20 μg di tubulina liofilizzato con etichetta. Vortice l’aliquota per 5 s a 30 rps. Raffreddi l’aliquota sul ghiaccio per 5 min prima di esso in incubazione a 37 ° C per 45 min e procedere alla sezione 1.3.3. Stabilizzazione dei microtubuli Aggiungere 5 μL della soluzione di paclitaxel aliquotati 490 μL di tampone di BRB80. Vortice la soluzione per 10 s a 30 rps. Una volta i 45 min di incubazione per i microtubuli sono fino, aggiungere 5 μL della soluzione di microtubuli polimerizzato per la soluzione di BRB80/paclitaxel.Nota: Questa soluzione 100 volte microtubule diluito, stabilizzato, sarà essere appresso MT100. Può essere utilizzato fino a 5 giorni, e può essere diluito per ottenere la densità desiderata dei microtubuli per ogni esperimento. Soluzione di motilità Antifade enzimatica, sistema di rigenerazione di ATP e ATP Aggiungere 9.0 μL della soluzione di caseina aliquotati 291 μL di tampone di BRB80. Se la concentrazione di ATP desiderata per l’esperimento è inferiore a 1 mM, dispensare 83 μL della soluzione di BRB80/caseina in un nuovo tubo del microcentrifuge 0,6 mL. In caso contrario, dispensare 85 μL della soluzione in un nuovo tubo del microcentrifuge 0,6 mL. Aggiungere 1 μL di D-glucosio, 1 μL di glucosio ossidasi, 1 μL di catalasi e 1 μL di DTT a quel tubo.Nota: Queste sostanze chimiche costituiscono un enzimatica antifade cocktail21 che ridurrà photobleaching rimuovendo dissolto i radicali reattivi dell’ossigeno e tempra. Questo riduce la disintegrazione photobleaching e microtubuli causata dall’illuminazione di eccitazione durante la fluorescenza imaging22,23. Per gli esperimenti in cui la concentrazione di ATP è scelto per essere significativamente più basso di 1 mM, aggiungere i seguenti reagenti per la soluzione di creare un sistema ATP-rigenerante: 1 μL della soluzione del fosfato della creatina aliquotati e 1 μL della creatina aliquotata soluzione di creatinfosfochinasi. Aggiungere 1 μL di soluzione di ATP riserva alla soluzione di motilità. Flick o vortice l’aliquota per distribuire omogeneamente i prodotti chimici.Nota: Così, la concentrazione finale di sostanze chimiche nella soluzione sono 10 μM paclitaxel, 0,5 mg·mL− 1 caseina, 20 mM D-glucosio, 200 μg·mL− 1 glucosio ossidasi, catalasi− 1 μg·mL 8, 10 mM dithiothreitol, 2mm creatina fosfato (se aggiunto), 2 Units· L− 1 creatina fosfochinasi (se aggiunto) e 1 mM ATP. Questa soluzione sarà essere appresso la soluzione di motilità. KinesinNota: La soluzione di kinesin stock utilizzata in questi esperimenti è preparata da G. Bachand presso il centro per le nanotecnologie integrato presso i Sandia National Laboratories e reso disponibile ai sensi di un accordo di utente (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). il buffer utilizzato qui è costituito da imidazolo di 40 mM, 300 mM NaCl, 0.76 g · L-1 EGTA, 37,2 magnesio · L-1 EDTA, 50 g · L-1 saccarosio, 0,2 mM TCEP e 50 μM Mg-ATP. Per questa serie di esperimenti, è stato utilizzato il costrutto di kinesin rkin430eGFP. Si tratta di una chinesina costituito i primo 430 amminoacidi della catena pesante di ratto chinesina fusa a eGFP e un C-terminale His-tag al dominio coda24. Esso è stato espresso in Escherichia coli e purificata utilizzando una colonna Ni−NTA. La concentrazione della soluzione stock GFP-chinesina era 1,8 ± 0,3 μM, come determinato mediante spettrofotometria UV/Vis, utilizzando un coefficiente di estinzione per GFP di 55 mM-1ma-1 489 nm25, e tenendo conto che kinesin è un dimero. Determinare la densità di concentrazione o superficie di kinesin desiderata per l’esperimento. Per i dosaggi tipici, questa concentrazione è di 20 nM. Se la concentrazione di kinesin deve essere diluito più di un centuplo, diluirlo in una soluzione di BRB80 che contiene mg·mL 0,5-1 della caseina. Aggiungere 1 µ l di soluzione di kinesin alla soluzione di motilità al fine di ottenere una concentrazione finale di circa 20 nM. Microtubuli Aggiungere 10 μL di soluzione MT100 preparata nella sezione 1.3 per la soluzione di motilità.Nota: Questa soluzione di motilità può essere utilizzata fino a 3 ore. Dopo quel tempo, il sistema antifade perde la sua efficacia perché il glucosio nella soluzione è esaurito dalla reazione enzimatica. 2. assemblare le celle di flusso Lavare i vetrini coprioggetti Per celle di flusso, utilizzare un grande vetrino coprioggetti (dimensione: 60 x 25 mm) e una piccola (dimensioni: 22 x 22 mm)19. Risciacquare tutti i vetrini coprioggetti due volte con etanolo e due volte con acqua ultrapura. Sottoporre ad ultrasuoni i coprioggetti in acqua ultrapura per 5 min. farli asciugare in un forno ad una temperatura di 50 – 75 ° C. Utilizzando un UV/ozono pulitore (Vedi Tabella dei materiali e le istruzioni del produttore), trattare un lato di ogni vetrino coprioggetto per 15 min. eseguire questo passaggio può a temperatura ambiente (~ 25 ° C) e in condizioni atmosferiche normali (pressione di 1 atm). Girare con cautela ogni vetrino coprioggetti al suo lato (utilizzando una pinzetta) e UV/ozono trattare quel lato pure. Sonicare lamelle in acqua ultrapura ancora per 5 minuti prima di asciugarli nuovamente in forno ad una temperatura di 50 – 75 ° C. Il trattamento di lamelle per abilitare rivestimento PEG-PPG-PEGNota: Il dimetildiclorosilano e il toluene utilizzato in questa parte del protocollo sono altamente tossici, effettuare le seguenti operazioni sotto cappa aspirante, mentre prendendo le seguenti precauzioni: indossare due set di guanti protettivi e una camicia a maniche lunghe sotto il loro laboratorio cappotto. Tuck i bordi dei guanti all’interno le maniche della camicia in modo che nessuna pelle da avambracci è direttamente esposto ai prodotti chimici in caso di un versamento. Indossare occhiali protettivi. Diluire 25 mL di puro dimetildiclorosilano in 475 mL di toluene. Immergere ogni vetrino coprioggetti in soluzione di dimetildiclorosilano e toluene per 15 secondi. Lavare i vetrini coprioggetti due volte in toluene e tre volte in metanolo. Asciugare i vetrini coprioggetti usando azoto pressurizzato. Montaggio vetrini coprioggetti in celle di flusso Una volta asciutti i coprioggetti, tagliare un pezzo di 2 x 2,5 cm di nastro biadesivo verticalmente in strisce di due 1 x 2,5 cm. Mettere il vetrino coprioggetto grande su un tergicristallo delicato compito e attaccare le strisce di nastro longitudinale lungo i bordi del coprivetrino per creare un’area di 1 x 2,5 cm tra i pezzi di nastro. Attaccare il piccolo vetrino coprioggetto sopra le strisce di nastro per completare il montaggio di cella di flusso. 3. scorrere le soluzioni in una cella di flusso La cella di flusso assemblato, fluiscono approssimativamente 20 μL della soluzione di PEG-PPG-PEG. Il volume che è volato nella cella deve essere grande abbastanza per riempire la camera. Nei passaggi successivi, è necessario utilizzare lo stesso volume quando si scambiano le soluzioni. Consentire la soluzione di PEG-PPG-PEG assorbire sulla superficie per 5 minuti. La soluzione di PEG-PPG-PEG con buffer di BRB80 Exchange 3 volte dal fluire il buffer in. Fluire la soluzione di motilità in cella di flusso. Sigillare i bordi della cella di flusso con grasso per prevenire l’evaporazione se l’esperimento pianificato è più di un’ora.Nota: La cella di flusso è ora pronta per essere imaged. 4. imaging una cella di flusso Eseguire l’imaging utilizzando un’installazione di fluorescenza (TIRF) di riflessione interna totale del tipo di obiettivo per i microtubuli e i motori di kinesin (Vedi Tabella materiali).Nota: Qui, abbiamo usato un microscopio con una x 100 / 1,49 obiettivo di apertura numerica, utilizzando due laser, uno con una lunghezza d’onda di 642 nm e una potenza massima di 140 mW e l’altro con lunghezza d’onda di 488 nm e una potenza massima di 150 mW. Mettere una goccia di olio per immersione sull’obiettivo. Posizionare la cella di flusso sulla piattaforma microscopio e portare l’obiettivo fino a quando non c’è contatto tra l’olio sull’obiettivo e la cella di flusso. Utilizzare sistema di copertura di interblocco del microscopio per bloccare tutta la luce laser di fuggire. Accendere il laser e concentrarsi sulla superficie inferiore della cella di flusso. I microtubuli sono fluorescente etichettati ed eccitati alla lunghezza d’onda di 647 nm. Essi saranno essere imaged utilizzando un laser di nanometro 642 mentre un 488 nm laser è utilizzato per i motori di GFP-chinesina. Registrare le immagini o i video di interesse. In genere, la potenza del laser è di circa 30 mW e un tempo di esposizione di 50 ms per entrambi canali laser. Immagini possono essere registrate per finchè c’è motilità nella cella di flusso.Nota: L’illuminazione laser è nocivo per l’occhio nudo e può causare danni irreparabili. Si prega di assicurarsi che l’area illuminata è completamente coperto con un coperchio opaco.