הרכבת המעבורות מולקולרי מופעל על ידי הפיכה מצורף Kinesins

1. פתרון הכנה התראה: שלושה ריאגנטים בשימוש פרוטוקול זה (טולואן, dimethyldichlorosilane ו dithiothreitol) נמצאים רעיל מאוד. נא עיין גליונות נתונים בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. יתר על כן, חלקים של פרוטוקול זה צריך להתבצע תחת רמה גבוהה יותר של הגנה, לובש בטיחות משקפיים, שני זוגות כפפות מגן כמצוין. אלא אם אחרת, שימו לב, ניתן לבצע את הניסויים על ספסלים המעבדה תוך שימוש כל את המתאים ציוד מגן אישי (בטיחות משקפיים, כפפות, חלוק המעבדה, באורך מלא מכנסיים ונעליים סגורות). הערה: ריכוז של ATP, קינזין, microtubules כי נמצאים בשימוש פרוטוקול זה יכול להיות שונה ניתנה על הצרכים של כל ניסוי. עם זאת, אם שינוי, נא ודא כי ריכוז סופי נוגדנים אחרים נשארים זהים שניתנו להלן. כל הניסויים בוצעו בטמפרטורת החדר, (~ 25 ° C). אופן ההכנה של פתרונות מניותהערה: להכין, aliquot הפתרונות הבאים מראש. ניתן להכין כל aliquots בטמפרטורת החדר (~ 25 ° C). מאגר BRB80הערה: המאגר עבור רוב הפתרונות בשימוש פרוטוקול זה הוא BRB80. BRB80 יכול להיות מוכן בכמויות גדולות ומאוחסנים במקפיא-20 ° C. להמיס 24.2 g של piperazine-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (צינורות) 3.1 גרם אשלגן הידרוקסידי (KOH) ב- 800 מ ל מים יונים לעשות 800 מ של צינורות 100 מ מ. להוסיף 100 מ של 10 מ מ מגנזיום כלוריד (MgCl2), 100 מ של 10 מ מ אתילן גליקול tetraacetic חומצה (EGTA) כדי לקבל נפח סופי של 1 ל’ להרים ה-pH 8 עם אשלגן הידרוקסידי (KOH) יכול לעזור להיעלמותו של צינורות, EGTA.הערה: ריכוזי כימיקלים במאגר BRB80 הסופי הם צינורות 80 מ מ, מ מ 1 MgCl2ו- 1 מ מ EGTA. התאם את רמת החומציות של המאגר כדי 6.9 באמצעות קו וחומצת מימן כלורי (HCl). ATP להכין פתרון 1 מ”ל של 100 מ מ ATP במים הנדסה גנטית. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-80 ° C. GTP להכין פתרון μL 500 של 25 מ מ GTP במים הנדסה גנטית. Pipet הפתרון לתוך 5 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-80 ° C. MgCl2 להכין פתרון 1 מ”ל של 100 מ מ MgCl2 במים הנדסה גנטית. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C. קזאין שוקל 1 גר’ קזאין יבש, להעביר אותו שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ. להוסיף 35 מ של מאגר BRB80 צינור כדי להמיס את האבקה קזאין. מקם את הפתרון לוליין בחדר קר להתמוסס במשך הלילה. בשלב זה, הפתרון ייראה צמיגה ועבה. להשאיר את הצינור זקוף במקרר 4 ° C כדי לאפשר כל גושים גדולים undissolved להתיישב. להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש. לסובב את הצינור ומפרידה ב x 1,000 g ל הצניפה החוצה יותר פוחת משקעים. שוב, להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש. שוב ושוב לסנן את הפתרון באמצעות מסננים μm (7 אטמוספרות המרבי) 0.2. הפתרון להיות עבה, מסננים רבים לקבל סתומים אז חזור על שלב זה עד המסנן נקי, מתפנה. לקבוע את הריכוז קזאין בפתרון הנוצרת באמצעות ספקטרופוטומטר UV/וויס, באמצעות מקדם הכחדה של קזאין של 19 מ מ-1∙cm-1 ב 280 nm20. בהנחה משקל מולקולרי של 23 kDa לנוכחות קזאין, לדלל את הפתרון ריכוז של mg∙mL 20-1 ב- BRB80. Pipet הפתרון לתוך 20 μL aliquots ולאחסן את aliquots במקפיא-20 ° C. D-גלוקוז להכין פתרון 1 מ”ל של 2 מ’ ד’-גלוקוז במים הנדסה גנטית. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C. גלוקוז אוקסידאז להכין פתרון 1 מ”ל של 20 mg∙mL-1 גלוקוז אוקסידאז ב- BRB80. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C. קטלאז להכין פתרון 1 מ”ל של 0.8 קטלאז-1 mg∙mL ב BRB80. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C. Dithiothreitol (DTT)הערה: מאז DTT הוא הפכפך מעט רעילים, נא בצע את השלבים הבאים תחת ברדס fume. להכין פתרון 1 מ”ל של 1 מ’ DTT מדולל במים הנדסה גנטית. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C. פקליטקסל להכין פתרון 1 מ”ל של 1 מ מ פקליטקסל מעורבבת עם דימתיל סולפוקסיד. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C. דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)הערה: דימתיל סולפוקסיד שימוש בניסויים אלה הוא טהור. Pipet 1 מ”ל של דימתיל סולפוקסיד טהור לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C. קריאטין פוספט להכין פתרון 1 מ”ל של 0.2 מ’ קראטין פוספט במים הנדסה גנטית. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C. קריאטין phosphokinase להכין פתרון 1 מ”ל של 200 units· L-1 קריאטין phosphokinase במים הנדסה גנטית. Pipet הפתרון לתוך 10 μL aliquots. אחסן את aliquots במקפיא-20 ° C. (II) ניקל סולפט הכנת 500 מ”ל של פתרון של 50 מ מ ניקל (II) סולפט במים הנדסה גנטית. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר (~ 25 ° C). פתרון Poly(ethylene glycol)-בלוק-poly(propylene glycol)-בלוק-poly(ethylene glycol) (פג-PPG-יתד) שוקלים לצאת 2 מ ג של פג-PPG-יתד (משקל מולקולרי ממוצע מספר: 14,600 g∙mol-1)-נ. ת. אבקה על שקילה נייר. פג-PPG-פג-נ הוא קופולימר triblock functionalized עם קבוצת nitrilotriacetic (נ) חומצה. עיין בטבלה של חומרים לקבלת פרטים נוספים אודות פג-PPG-פג-נ. ת. להעביר את האבקה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. להוסיף 1 מ”ל של הפתרון סולפט ניקל (II) מניות ברכבת התחתית. מערבולת עד אבקה היא התפרקה ובתצורות גלוי לא נשארים. חנות עד לחודש בטמפרטורת החדר. לפני תחילת הניסוי למלא דלי עם קרח. לקחת aliquot אחד מכל אחת ריאגנטים 13 שמתואר בסעיפים 1.1.1 כדי 1.1.13 מעל ולהוסיף אותן לדלי, ובכך להשאיר אותם על קרח. הפשרת כל אחד ריאגנטים לפני השימוש. הכנה microtubuleהערה: Microtubules היו polymerized מ aliquot 20 μg של התווית על-ידי צבע טובולין lyophilized. אורך הגל עירור של לצבוע היא של 647 ננומטר. הכנת המאגר צמיחה microtubule Pipet 21.8 μL BRB80 מאגר לתוך microcentrifuge קטן (0.6 מ”ל) הצינור. להוסיף 1 μL של הפתרון מניות של2 MgCl, 1 μL של הפתרון מניות GTP ו- 1.2 μL של הפתרון מניות דימתיל סולפוקסיד.הערה: כך, ריכוזי הסופי ריאגנטים במאגר BRB80 הם 4 מ מ MgCl2, 1 מ”מ GTP ו 5% (v/v) דימתיל סולפוקסיד. Microtubule פלמור להוסיף μL 6.25 microtubule צמיחה המאגר ישירות לתוך aliquot 20 μg של טובולין lyophilized עם תוויות. מערבולת aliquot עבור 5 s ב 30 rps. להתקרר את aliquot על הקרח במשך 5 דקות לפני המקננת זה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות והמשך סעיף 1.3.3. Microtubule מייצב להוסיף 5 μL של הפתרון פקליטקסל aliquoted μL 490 מאגר BRB80. מערבולת הפתרון עבור 10 s ב 30 rps. לאחר 45 min של דגירה עבור microtubules למעלה, להוסיף 5 μL של הפתרון polymerized microtubule הפתרון BRB80/פקליטקסל.הערה: פתרון microtubule מדולל, התייצב, 100-fold זה להיות ןלהל MT100. ניתן להשתמש עד 5 ימים, זה יכול להיות מדולל כדי להשיג צפיפות microtubule הרצויה עבור כל ניסוי. תנועתיות פתרון Antifade אנזימטיות, ATP נוצר מחדש מערכת ו- ATP להוסיף μL 9.0 של הפתרון קזאין aliquoted μL 291 מאגר BRB80. אם ריכוז ATP הרצוי עבור הניסוי הוא נמוך מ 1 מ”מ, pipet 83 μL של הפתרון BRB80/קזאין לתוך צינור microcentrifuge החדש של 0.6 מ”ל. אחרת, pipet 85 μL של פתרון זה לתוך צינור microcentrifuge החדש של 0.6 מ”ל. להוסיף 1 μL של D-גלוקוז, 1 μL של גלוקוז אוקסידאז, μL 1 של קטלאז μL 1 של DTT השפופרת הזאת.הערה: כימיקלים אלה מהווים אנזימטי של קוקטייל antifade21 תפחית photobleaching על-ידי הסרת התפרקה רדיקלים תגובתי חמצן, שכבתה. זה מפחית התפוררות photobleaching ו microtubule הנגרמת על ידי ההארה עירור במהלך פלורסצנטיות הדמיה22,23. לניסויים שבהם ריכוז ATP הוא נבחר להיות נמוך משמעותית מאשר 1 מ מ, להוסיף ריאגנטים הבאים את הפתרון ליצירת מערכת ATP-רגנרציה: 1 μL של הפתרון aliquoted קראטין פוספט, μL 1 של קריאטין aliquoted פתרון phosphokinase. להוסיף 1 μL של הפתרון ATP מניות הפתרון תנועתיות. פליק או מערבולת aliquot למשל הפצת הכימיקלים.הערה: כך, הריכוז הסופי של כימיקלים בפתרון הם 10 μM פקליטקסל, 0.5 mg·mL− 1 קזאין, 20 מ מ D-גלוקוז, 200 μg·mL− 1 גלוקוז אוקסידאז, 8 μg·mL− 1 קטלאז, dithiothreitol 10 מ מ, 2 מ מ קריאטין פוספט (אם נוסף), 2 units· L− 1 קריאטין phosphokinase (אם נוסף), 1 מ מ ATP. פתרון זה להיות ןלהל הפתרון תנועתיות. קינזיןהערה: הפתרון קינזין מניות שימוש בניסויים אלה שהוכנו על ידי G. Bachand במרכז על ננוטכנולוגיה משולב במעבדות סנדיה הלאומי והוא זמין תחת הסכם המשתמש (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php)-המאגר המשמש כאן מורכב 40 מ מ imidazole, 300 מ”מ NaCl, 0.76 g· L-1 EGTA, 37.2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 סוכרוז, 0.2 מ מ TCEP ו 50 μM מ ג-ATP. עבור סדרת ניסויים, שימש הבונה קינזין rkin430eGFP. . זה קינזין המורכב מחומצות האמינו תחילה 430 של עכברוש קינזין שרשרת כבדה דבוקה eGFP ותג C-מסוף שלו-התחום הזנב24… זה בא לידי ביטוי ב- Escherichia coli ו לטהר על-ידי עמודה Ni−NTA. הריכוז של הפתרון מניות GFP-קינזין היה 1.8 μM ± 0.3 כפי שנקבע על ידי ספקטרופוטומטר UV/וויס, באמצעות מקדם הכחדה של GFP של 55 מ מ-1·cm-1 nm 48925, לוקח בחשבון את קינזין דיימר. לקבוע קינזין הרצוי ריכוז או משטח הצפיפות של הניסוי. עבור מבחני טיפוסי, הריכוז הזה הוא 20 ננומטר. אם ריכוז קינזין צריך לדלל יותר hundred-fold, למהול אותו בריכוז של BRB80 המכילה 0.5 mg·mL-1 של קזאין. להוסיף 1 µL של פתרון קינזין הפתרון תנועתיות כדי לקבל ריכוז סופי של 20 שנהנתם ננומטר. Microtubules להוסיף 10 μL של הפתרון MT100 מוכן בסעיף 1.3 לפתרון של תנועתיות.הערה: פתרון תנועתיות זה יכול לשמש עד 3 שעות. לאחר מכן, מערכת antifade מאבדת את האפקטיביות שלה מפני שהגלוקוז בפתרון תיגמר על ידי התגובה אנזימטיות. 2. בניית תאי זרימה לשטוף את coverslips עבור תאים זרימה, השתמש coverslip גדול (ממד: 60 מ”מ x 25 מ”מ) וקטן (מידות: 22 מ”מ x 22 מ”מ)19. לשטוף כל coverslips פעמיים עם אתנול, פעמיים עם מים הנדסה גנטית. Sonicate על coverslips במים הנדסה גנטית עבור 5 דק לייבש אותם בתנור בטמפרטורה של 50-75 מעלות צלזיוס. באמצעות UV/אוזון מנקה (ראה טבלה של חומרים , הוראות היצרן), לטיפול בצד אחד של כל coverslip במשך 15 דקות לבצע שלב זה ניתן בטמפרטורת החדר (~ 25 ° C), במצב נורמלי אטמוספרי (לחץ של 1 atm). בזהירות להפוך כל coverslip על הצד השני שלו (באמצעות פינצטה), UV/אוזון להתייחס גם את הצד הזה. Sonicate על coverslips במים הנדסה גנטית שוב למשך 5 דקות לפני ייבוש אותם שוב בתנור בטמפרטורה של 50-75 מעלות צלזיוס. בטיפול על coverslips כדי לאפשר ציפוי פג-PPG-יתדהערה: את dimethyldichlorosilane, את טולואן להשתמש בחלק זה של הפרוטוקול להיות רעיל מאוד, בצע את השלבים הבאים ברדס fume, בעודם סופגים את אמצעי הזהירות הבאים: ללבוש שני זוגות כפפות מגן וחולצה עם שרוולים ארוכים תחת במעבדה שלהם את המעיל. מתיחת הקצוות של הכפפות פנימה השרוולים של החולצה כך אין העור מן האמות חשוף ישירות הכימיקלים במקרה של דליפה. משקפיים מגן. לדלל 25 מ של dimethyldichlorosilane טהור ב- 475 מ של טולואן. לטבול כל coverslip ב הפתרון dimethyldichlorosilane, טולואן למשך 15 שניות. לשטוף את coverslips פעמיים טולואן, שלוש פעמים מתנול. יבש את coverslips באמצעות חנקן בלחץ. בהרכבת coverslips לתוך תאים זרימה ברגע coverslips יבשים, תחתכי 2 ס”מ x 2.5 ס”מ נייר-דבק דו צדדי לאורך לרצועות שני 1 ס”מ x 2.5 ס”מ. לשים את coverslip גדול מגב המשימה העדינה ולהישאר הפסים הקלטת לאורכו לאורך קצות coverslip כדי ליצור אזור 1 ס”מ x 2.5 ס”מ בין החלקים של הקלטת. לתקוע את coverslip קטן על גבי הפסים הקלטת כדי לסיים את מכלול תא זרימה. 3. זורם את הפתרונות לתא זרימה זורמים שנהנתם 20 μL של הפתרון פג-PPG-יתד לתוך התא זרימה מורכבים. אמצעי האחסון שטס בתא חייב להיות גדול מספיק כדי למלא את החדר. בשלבים הבאים, השתמש באותו אמצעי אחסון כאשר מחליפים את הפתרונות. לאפשר הפתרון פג-PPG-יתד לספוג על פני השטח במשך 5 דקות. חילופי הפתרון פג-PPG-יתד עם מאגר BRB80 3 פעמים על ידי זורם למאגר ב. זורמים הפתרון תנועתיות לתוך התא זרימה. לאטום את הקצוות של התא זרימה עם גריז כדי למנוע אידוי אם הניסוי המתוכנן הוא יותר משעה.הערה: תא זרימה מוכן כעת ליצירת תמונה. 4. הדמיה תא זרימה ביצוע ההדמיה באמצעות התקנה קרינה פלואורסצנטית (TIRF) המטרה-סוג החזרה גמורה microtubules וגם את המנועים קינזין (ראה טבלה של חומרים).הערה: כאן, השתמשנו מיקרוסקופ עם 100 x / 1.49 מפתח נומרי המטרה עדשה, באמצעות לייזרים שני, אחד עם אורך גל של 642 nm ו כוח מרבי של 140 mW, ועוד אחד עם אורך גל של 488 ננומטר, כוח מרבי של 150 mW. במקום טיפה של שמן טבילה על המטרה. למקם את התא זרימה על פלטפורמת מיקרוסקופ ולהביא המטרה עד יש קשר בין התא זרימת השמן על המטרה. השתמש interlock כיסוי המערכת של המיקרוסקופ כדי לחסום כל אור לייזר מלברוח. להפעיל את הלייזר ולהתמקד על צידם התחתון של התא זרימה. Microtubules מתויג, מתרגש באורך-גל של 647 fluorescently ננומטר. הם ידומה, באמצעות לייזר nm 642 בזמן 488 ננומטר לייזר משמש את המנועים GFP-קינזין. להקליט את תמונות או קטעי וידאו של ריבית. בדרך כלל, עוצמת הלייזר הוא כ 30 mW וזמן חשיפה של 50 מילישניות לשניהם לייזר ערוצים. ניתן להקליט תמונות עבור כל עוד יש תנועתיות בתא זרימה.הערה: ההארה לייזר מזיק בעין והוא יכול לגרום נזק בלתי הפיך. נא ודא כי השטח מכוסה לגמרי עם מכסה אטום.