Montage von molekularen Shuttles Powered by reversibel befestigt Kinesine

1. Vorbereitung der Lösung Achtung: Drei der in diesem Protokoll (Toluol, siliciumhaltigen und Dithiothreitol) verwendeten Reagenzien sind hochgiftig. Konsultieren Sie bitte die entsprechenden Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch. Darüber hinaus Teile dieses Protokolls unter ein höheres Maß an Schutz, Schutzbrille und zwei Sätze von Schutzhandschuhe tragen, wie angegeben durchgeführt werden müssen. Sofern nichts anderes empfohlen, können die Experimente auf Laborbänke durchgeführt werden, wobei alle die geeignete persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe). Hinweis: Die Konzentrationen von ATP, Kinesin und Mikrotubuli, die in diesem Protokoll verwendet werden können angesichts der Bedürfnisse jedes Experiment geändert werden. Jedoch wenn geändert, Bitte stellen Sie sicher, dass die Endkonzentrationen der anderen Reagenzien die gleichen wie bleiben unten. Alle Versuche wurden bei Raumtemperatur (~ 25 ° C) durchgeführt. Vorbereitung der StammlösungenHinweis: Vorbereiten und aliquoten folgenden Lösungen im Voraus. Alle Aliquote können bei Raumtemperatur (~ 25 ° C) zubereitet werden. BRB80 PufferHinweis: Der Puffer für die meisten der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen ist BRB80. BRB80 werden in großen Mengen zubereitet und in einer Tiefkühltruhe-20 ° C gelagert. Lösen Sie 24,2 g Piperazin-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (Rohre) und 3,1 g Kaliumhydroxid (KOH) in 800 mL entionisiertem Wasser, 800 mL 100-mM-Rohre zu machen. Fügen Sie 100 mL 10 mM Magnesiumchlorid (MgCl2) und 100 mL 10 mM Ethylenglykol-Tetraacetic Säure (EGTA) zu einem Endvolumen von 1 L. Raising der pH-Wert auf 8 mit Kalilauge (KOH) in der Auflösung von Rohren und EGTA helfen kann.Hinweis: Die Endkonzentrationen von Chemikalien in der BRB80-Puffer sind 80-mM-Rohre, 1 mM MgCl2und 1 mM EGTA. Stellen Sie den pH-Wert des Puffers zu 6,9 mit KOH und Salzsäure (HCl). ATP Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 100 mM ATP Reinstwasser. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Die Aliquote in einem-80 ° C Gefrierschrank aufbewahren. GTP Bereiten Sie eine 500 μl Lösung von 25 mM GTP Reinstwasser. Die Lösung in 5 μL Aliquote pipettieren. Die Aliquote in einem-80 ° C Gefrierschrank aufbewahren. MgCl2 Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 100 mM MgCl2 Reinstwasser. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C. Kasein Wiegen 1 g der trockenen Kasein und überträgt es auf einem konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL. Fügen Sie 35 mL BRB80-Puffer mit dem Rohr, das Casein Pulver aufzulösen. Legen Sie die Lösung in einem Tumbler in einem kalten Raum über Nacht auflösen. An diesem Punkt sieht die Lösung dick und zähflüssig. Lassen Sie das Rohr aufrecht in einem Kühlschrank 4 ° C erlauben großen ungelösten Klumpen zu begleichen. Übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Schlauch. Drehen Sie das Rohr in einer Zentrifuge bei 1.000 X g zu Pellets, mehr Ausscheidungen. Übertragen Sie den Überstand noch einmal zu einem neuen Schlauch Immer wieder filtern Sie die Lösung mit Hilfe von 0,2 μm (7 bar Maximaldruck) filtern. Die Lösung zu dick, viele Filter verstopft werden, so wiederholen Sie diesen Schritt, bis der Filter klar ist und unclogged. Bestimmen Sie die Kasein-Konzentration in der resultierenden Lösung mit UV/Vis-Spektrophotometrie, mit Kasein Aussterben Koeffizient von 19 mM-1∙cm-1 bei 280 nm20. Angenommen, ein Molekulargewicht von 23 kDa für Kasein, verdünnen Sie die Lösung zu einer Konzentration von 20 Mg∙mL-1 in BRB80. Die Lösung in 20 μl-Aliquots pipettieren und speichern die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C. D-Glucose Bereiten Sie eine 1 mL Lösung 2 M D-Glucose in Reinstwasser. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C. Glukose-oxidase Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 20 Mg∙mL-1 Glukose-Oxidase in BRB80. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C. Katalase Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 0,8 Mg∙mL-1 Katalase in BRB80. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C. Dithiothreitol (DTT)Hinweis: Da DTT leicht flüchtig und giftig ist, bitte führen Sie folgende Schritte unter einem Abzug. Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 1 M DTT in ultrareinem Wasser verdünnt. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C. Paclitaxel Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 1 mM Paclitaxel in DMSO verdünnt. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C. Dimethyl Sulfoxid (DMSO)Hinweis: Die DMSO verwendet in diesen Experimenten ist rein. 1 mL reines DMSO in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C. Kreatin-Phosphat Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 0,2 M Kreatinphosphat in Reinstwasser. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C. Kreatin-Creatinphosphokinase Bereiten Sie eine 1 mL Lösung von 200 units· L-1 Kreatin Creatinphosphokinase Reinstwasser. Die Lösung in 10 μl-Aliquots pipettieren. Speichern Sie die Aliquote in einem Gefrierschrank-20 ° C. Nickel (II) Sulfat 500 mL einer Lösung von 50 mM Nickel (II) Sulfat Reinstwasser vorzubereiten. Speichern Sie die Lösung bei Raumtemperatur (~ 25 ° C). Poly(Ethylene Glycol)-Block-Poly(propylene glycol)-Block-Poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) Lösung 2 mg von PEG-PPG-PEG Abwiegen (Nummer mittleres Molekulargewicht: 14.600 G∙mol-1)-NTA Puder mit einem Gewicht von Papier. PEG, PPG, PEG-NTA ist die Tribloc-Copolymer funktionalisiert mit einem Nitrilotriacetic Säuregruppe (NTA). Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für mehr Details über die PEG-PPG-PEG-NTA. Übertragen Sie das Pulver in einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 1 mL der Stammlösung Nickel (II) Sulfat mit dem Rohr. Vortex bis Pulver aufgelöst ist und keine sichtbaren Klumpen bleiben. Speicher für bis zu einem Monat bei Raumtemperatur. Vor dem Start eines Experiments Füllen Sie einen Eimer mit Eis. Nehmen Sie eine Aliquote aus jedem der 13 Reagenzien in Abschnitten 1.1.1 zu 1.1.13 oben beschrieben und fügen Sie sie in den Eimer, so halten sie auf dem Eis. Jeder der Reagenzien vor dem Gebrauch auftauen. Mikrotubuli-VorbereitungHinweis: Mikrotubuli wurden von einer 20 μg aliquoten von Farbstoff-markierten lyophilisierter Tubulin polymerisiert. Die Erregung Wellenlänge des Farbstoffs ist von 647 nm. Vorbereitung des Puffers Mikrotubuli Wachstum Pipettieren 21,8 μl BRB80-Puffer in einem kleinen (0,6 mL) Microcentrifuge Schlauch. 1 μl der Vorratslösung MgCl2 , 1 μL der Vorratslösung GTP und 1,2 μL der Vorratslösung DMSO hinzufügen.Hinweis: Damit sind die Endkonzentrationen der Reagenzien im BRB80 Puffer 4 mM MgCl2, 1 mM GTP und 5 % (V/V) Dimethyl Sulfoxid. Mikrotubuli-Polymerisation Fügen Sie 6,25 μL der Mikrotubuli Wachstum Puffer direkt in eine 20 μg aliquoten von beschrifteten lyophilisierter Tubulin. Wirbel der aliquoten für 5 s bei 30 rps. Kühlen Sie die aliquoten für 5 min auf Eis ab, bevor Sie bei 37 ° C für 45 min Inkubation und fahren Sie mit Abschnitt 1.3.3. Stabilisierung der Mikrotubuli 490 μl BRB80-Puffer 5 μL der regelmÄÑig Paclitaxel-Lösung hinzufügen. Wirbel die Lösung für 10 s bei 30 rps. Sobald die 45 min Inkubation für die Mikrotubuli sind oben, fügen Sie 5 μL der polymerisierten Mikrotubuli-Lösung der BRB80/Paclitaxel-Projektmappe hinzu.Hinweis: Diese 100-fold verdünnt, stabilisiert, Mikrotubuli-Lösung wird im folgenden als MT100 bezeichnet werden. Es eignet sich für bis zu 5 Tage, und es kann verdünnt werden, um die gewünschte Mikrotubuli-Dichte für jedes Experiment zu erhalten. Motilität Lösung Enzymatische Antifade, regenerierende System ATP und ATP 291 μl BRB80-Puffer 9.0 μL der regelmÄÑig Kasein-Lösung hinzufügen. Wenn die gewünschte ATP-Konzentration für das Experiment kleiner als 1 mM, Pipettieren 83 μL der BRB80/Kasein-Lösung zu einem neuen 0,6 mL Microcentrifuge Schlauch ist. Ansonsten, Pipettieren 85 μl der Lösung zu einem neuen 0,6 mL Microcentrifuge Schlauch. Diese Röhre 1 μL der D-Glucose, 1 μL von Glukose-Oxidase, 1 μL der Katalase und 1 μL von DVB-t hinzufügen.Hinweis: Diese Chemikalien bilden eine enzymatische antifade cocktail21 , die die Immunofluoreszenz durch Entfernen reduzieren gelösten Sauerstoff und abschrecken reaktive Radikale. Dies reduziert Immunofluoreszenz und Mikrotubuli Zerfall verursacht durch die Erregung Beleuchtung während der Fluoreszenz imaging22,23. Für Experimente, in denen die ATP-Konzentration gewählt wird, um deutlich unter 1 mM, fügen die folgenden Reagenzien zur Lösung eines ATP-Regeneration-Systems: 1 μL regelmÄÑig Kreatin-Phosphat-Lösung und 1 μL regelmÄÑig Kreatin Creatinphosphokinase Lösung. Die Motilität-Lösung 1 μl der Stammlösung ATP hinzufügen. Flick oder Wirbel aliquoten Chemikalien homogen verteilen.Hinweis: Damit die Endkonzentration von Chemikalien in der Lösung sind 10 μM Paclitaxel, 0,5 Mg·mL−1 Kasein, 20 mM D-Glucose, 200 μg·mL−1 Glukose-Oxidase, 8 μg·mL−1 Katalase, 10 mM Dithiothreitol, 2 mM-Kreatin-Phosphat (sofern hinzugefügt), 2 Units· L−1 Kreatin Creatinphosphokinase (sofern hinzugefügt) und 1 mM ATP. Diese Lösung wird im folgenden die Motilität-Lösung genannt werden. KinesinHinweis: In diesen Experimenten verwendeten Lager Kinesin-Lösung von G. Crying im Zentrum für integrierte Nanotechnologien an den Sandia National Laboratories vorbereitet und unter einer Nutzungsvereinbarung (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php) zur Verfügung gestellt. der Puffer verwendet, hier besteht aus 40 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 0,76 G· L-1 EGTA, 37,2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 Saccharose, 0,2 mM DÄMMUND und 50 μM Mg-ATP. Für diese Serie von Experimenten wurde das rkin430eGFP Kinesin Konstrukt verwendet. Dies ist ein Kinesin bestehend aus die ersten 430 Aminosäuren der Ratte Kinesin schwere Kette mit eGFP und eine C-terminale His-Tag an der Rute Domäne24verschmolzen. Es drückte sich in Escherichia coli und gereinigt, mit einer Ni−NTA-Spalte. Die Konzentration der GFP-Kinesin Vorratslösung war 1,8 ± 0,3 μM gemäß UV/Vis-Spektrophotometrie, mit einem Aussterben Koeffizienten für GFP von 55 mM-1·cm-1 bei 489 nm25, und unter Berücksichtigung, dass Kinesin ist ein Dimer. Bestimmen Sie die gewünschte Kinesin Konzentration oder Oberfläche Dichte für das Experiment. Diese Konzentration ist für typische Assays, 20 nM. Wenn die Kinesin-Konzentration muss verdünnt werden mehr als hundertfach, verdünnen Sie es in einer Lösung von BRB80, die 0,5 Mg·mL-1 Casein enthält. Die Motilität-Lösung 1 µL Kinesin-Lösung hinzufügen, um eine Endkonzentration von etwa 20 bekommen nM. Mikrotubuli Fügen Sie 10 μL der MT100 Lösung in Abschnitt 1.3 der Motilität Lösung vorbereitet.Hinweis: Diese Motilität-Lösung kann bis zu 3 Stunden verwendet werden. Nach dieser Zeit verliert das antifade System seine Wirksamkeit, weil die Glucose in der Lösung durch die enzymatische Reaktion aufgebraucht ist. 2. Montage der Durchflusszellen Waschen der Deckgläsern Für Durchflusszellen, verwenden eine große Deckglas (Dimension: 60 x 25 mm) und einer kleinen (Abmessungen: 22 x 22 mm)19. Spülen Sie alle Deckgläsern zweimal mit Ethanol und zweimal mit Reinstwasser. Beschallen Sie die Deckgläsern Reinstwasser für 5 min. Trocknen im Ofen bei einer Temperatur von 50 – 75 ° C. Mit einem UV/Ozon cleaner (siehe Tabelle der Werkstoffe und Anweisungen des Herstellers), einseitig jedes Deckglas für 15 min. führen diesen Schritt kann zu behandeln, bei Raumtemperatur (~ 25 ° C) und in normalen atmosphärischen Bedingungen (Druck von 1 atm). Drehen Sie vorsichtig jede Deckglas auf die andere Seite (mit einer Pinzette) und dieser Seite sowie UV/Ozon behandeln. Beschallen Sie die Deckgläsern Reinstwasser wieder für 5 min vor dem Trocknen sie wieder in den Ofen bei einer Temperatur von 50 – 75 ° C. Behandlung von Deckgläsern PEG-PPG-PEG Beschichtung ermöglichenHinweis: Die siliciumhaltigen und das Toluol verwendet in diesem Teil des Protokolls wird hochgiftig, führen Sie folgende Schritte unter einem Abzug während der Einnahme der folgenden Vorsichtsmaßnahmen: tragen Sie zwei Sätze von Schutzhandschuhen und ein Langarm-Shirt unter ihrem Labor Mantel. Stecken Sie die Kanten von Handschuhen in die Ärmel des Hemdes, damit keine Haut aus den Unterarmen die Chemikalien im Falle einer Verschüttung direkt ausgesetzt ist. Tragen Sie Schutzbrille. Verdünnen Sie 25 mL des reinen siliciumhaltigen in 475 mL Toluol. Tauchen Sie jedes Deckglas in die siliciumhaltigen und Toluol Lösung für 15 Sekunden. Waschen Sie die Deckgläsern, zweimal in Toluol und dreimal in Methanol. Trocknen Sie die Deckgläsern mit unter Druck stehenden Stickstoff. Montage von Deckgläsern in Durchflusszellen Sobald die Deckgläsern trocken sind, schneiden Sie ein 2 x 2,5 cm Stück doppelseitigem Klebeband vertikal in zwei 1 x 2,5 cm Streifen. Eine heikle Aufgabe Wischer setzen Sie die große Deckglas auf und kleben Sie die Klebeband-Streifen längs entlang der Kanten des Deckglases zur Schaffung eines 1 x 2,5 cm zwischen den Stücken der Band. Halten Sie den kleinen Deckglas auf die Klebeband-Streifen, Zelle Fließmontage zu beenden. 3. fließen die Lösungen in einer Durchflusszelle Die montierten Durchflusszelle fließen Sie ca. 20 μL der PEG-PPG-PEG-Lösung. Das Volumen, das in der Zelle geflogen wird muss groß genug sein, den Saal zu füllen. Verwenden Sie in den nächsten Schritten das gleiche Volumen beim Austausch von Lösungen. Die PEG-PPG-PEG-Lösung für 5 Minuten an der Oberfläche aufnehmen lassen. Tauschen Sie die PEG-PPG-PEG-Lösung mit BRB80 Puffer durch fließt des Puffers in 3 Mal aus. Fließen Sie die Motilität-Lösung in der Messzelle. Versiegeln Sie die Kanten der Messzelle mit Fett um Verdunstung zu verhindern, wenn das geplante Experiment mehr als eine Stunde.Hinweis: Die Durchflusszelle ist jetzt bereit, abgebildet werden. 4. imaging eine Durchflusszelle Führen Sie die Bildgebung mit einem Ziel-Typ Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) Setup für die Mikrotubuli und die Kinesin-Motoren (siehe Tabelle der Materialien).Hinweis: Hier, verwendeten wir ein Mikroskop mit einem 100 X / 1,49 numerische Apertur Objektiv, mit zwei Lasern, eins mit einer Wellenlänge von 642 nm und eine maximale Leistung von 140 mW, und zum anderen mit der Wellenlänge von 488 nm und eine maximale Leistung von 150 mW. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl, auf das Ziel. Die Mikroskop-Plattform setzen Sie die Durchflusszelle auf und bringen Sie das Ziel, bis zum Kontakt zwischen das Öl auf das Ziel und der Messzelle. Mithilfe des Mikroskops Verriegelungssystem Abdeckung um alle Laser-Licht an der Flucht zu blockieren. Schalten Sie den Laser und konzentrieren Sie sich auf der unteren Fläche der Messzelle. Die Mikrotubuli sind Eindringmittel gekennzeichnet und begeistert bei einer Wellenlänge von 647 nm. Sie werden mit einem 642 nm Laser, während eine 488 nm-Laser für die GLP-Kinesin-Motoren verwendet wird abgebildet werden. Notieren Sie die Bilder oder Videos von Interesse. In der Regel ist die Laserleistung von ca. 30 mW und einer Belichtungszeit von 50 ms für beide laser-Kanäle. Bilder können für aufgezeichnet werden, solange es Motilität in der Messzelle gibt.Hinweis: Das Laser-Licht ist schädlich für das Auge und kann irreparable Schäden verursachen. Bitte stellen Sie sicher, dass das Leuchtfeld komplett mit einem undurchsichtigen Deckel bedeckt ist.