Assemblage des navettes moléculaires propulsés par réversiblement attaché kinésines

1. préparation de la solution Attention : Trois des réactifs utilisés dans le présent protocole (toluène, diméthyldichlorosilane et le dithiothréitol) sont très toxiques. S’il vous plaît consulter les pertinente fiches signalétiques (FS) avant utilisation. Par ailleurs, certaines parties de ce protocole doivent être assujettis à un niveau plus élevé de protection, portant des lunettes de sécurité et deux paires de gants de protection comme indiqué. Sauf avis contraire, les expériences peuvent être réalisées sur des bancs de laboratoire en utilisant tous le personnel équipement de protection approprié (lunettes, gants, blouse, pleine longueur pantalons et chaussures fermées). Remarque : Les concentrations de l’ATP, la kinésine et microtubules qui sont utilisés dans le présent protocole peuvent être modifiées compte tenu des besoins de chaque expérience. Toutefois, si modifié, veuillez vous assurer que les concentrations finales des autres réactifs restent le même comme indiqué ci-dessous. Toutes les expériences ont été réalisées à température ambiante, (~ 25 ° C). Préparation des solutions mèresNOTE : Préparer et aliquote les solutions suivantes au préalable. Toutes les parties aliquotes peuvent être préparés à la température ambiante (environ 25 ° C). BRB80 tamponRemarque : La mémoire tampon pour la plupart des solutions utilisées dans le présent protocole est BRB80. BRB80 peut être préparé en grande quantité et stocké dans un congélateur à-20 ° C. Dissoudre 24,2 g de pipérazine-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (tuyaux) et 3,1 g d’hydroxyde de potassium (KOH) dans 800 mL d’eau désionisée faire 800 mL de tuyaux de 100 mM. Ajouter 100 mL 10 mM chlorure de magnésium (MgCl2) et 100 mL d’acide tétraacétique de 10 mM l’éthylène glycol (EGTA) pour obtenir un volume final de 1 L. Elévation du pH à 8 avec l’hydroxyde de potassium (KOH) peut aider à la dissolution des tuyaux et l’EGTA.Remarque : Les concentrations finales des produits chimiques dans le tampon de BRB80 sont des tuyaux de 80 mM, 1 mM MgCl2et 1 mM EGTA. Ajuster le pH de la mémoire tampon à 6,9 à l’aide de KOH et acide chlorhydrique (HCl). ATP Préparer une solution de 1 mL de 100 mM ATP dans l’eau ultrapure. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-80 ° C. GTP Préparer une solution de 500 μL de 25 mM GTP dans de l’eau ultrapure. Pipette de la solution en 5 aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-80 ° C. MgCl2 Préparer une solution de 1 mL de 100 mM MgCl2 dans de l’eau ultrapure. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C. Caséine Peser 1 g de caséine sèche et transférez-le dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Ajouter 35 mL de tampon de BRB80 dans le tube pour dissoudre la poudre de caséine. Placer la solution dans un verre dans une chambre froide pour dissoudre toute la nuit. À ce stade, la solution se penchera épais et visqueux. Maintenir le tube verticalement dans un réfrigérateur de 4 ° C pour permettre toute grosses touffes non dissous à régler. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Tourner le tube dans une centrifugeuse à 1 000 x g pour granuler des précipités plus. Une fois de plus, transférer le surnageant dans un nouveau tube. À plusieurs reprises, filtrer la solution à l’aide de 0,2 μm (7 bar pression maximale) filtres. La solution étant épais, beaucoup de filtres se colmatera, alors Répétez cette étape jusqu’à ce que le filtre soit clair et débarrassé. Déterminer la concentration de caséine dans la solution obtenue à l’aide de spectrophotométrie UV/visible, à l’aide du coefficient d’extinction de caséine de 19 mM-1∙cm-1 à 280 nm20. En supposant que le poids moléculaire 23 kDa pour la caséine, diluer la solution à une concentration de 20 mg∙mL-1 dans BRB80. Pipette de la solution en 20 parties aliquotes μL et stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C. D-Glucose Préparer une solution de 1 mL de 2 M de D-glucose dans de l’eau ultrapure. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C. Glucose oxydase Préparer une solution de 1 mL de 20 mg∙mL-1 glucose oxydase dans BRB80. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C. Catalase Préparer une solution de 1 mL de 0,8 catalase-1 de mg∙mL en BRB80. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C. Dithiothréitol (DTT)Remarque : Étant donné que TNT est légèrement volatil et toxique, s’il vous plaît effectuez les opérations suivantes sous une hotte aspirante. Préparer une solution de 1 mL de 1 M DTT dilué dans de l’eau ultrapure. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C. Paclitaxel Préparer une solution de 1 mL de 1 mM de paclitaxel diluée dans le DMSO. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C. Le diméthylsulfoxyde (DMSO)Remarque : Le DMSO utilisé dans ces expériences est pur. Pipette 1 mL de DMSO pur en 10 aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C. Créatine phosphate Préparer un 1 mL de solution de phosphate de créatine 0,2 M dans l’eau ultrapure. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C. Créatine phosphokinase Préparer une solution de 1 mL de 200 units· L-1 créatine phosphokinase dans de l’eau ultrapure. Ajouter cette solution dans 10 parties aliquotes μL. Stocker les aliquotes dans un congélateur à-20 ° C. Sulfate de nickel (II) Préparer 500 mL d’une solution de sulfate de nickel (II) de 50 mM dans de l’eau ultrapure. Conserver la solution à température ambiante (environ 25 ° C). Poly(ethylene glycol)-bloc-poly(propylene glycol)-bloc-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) solution Peser 2 mg de PEG-PPG-PEG (masse moléculaire moyenne en nombre : 14 600 g∙mol-1)-poudre NTA sur papier de pesage. PEG-PPG-PEG-NTA est le copolymère tribloc fonctionnalisé avec un groupe de (NTA) acide nitrilotriacétique. Se référer à la Table des matières pour plus de détails sur le PEG-PPG-PEG-NTA. Transférer la poudre dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Ajouter 1 mL de la solution mère de sulfate de nickel (II) dans le tube. Vortex jusqu’à ce que la poudre se dissout et aucun touffes visibles demeurent. Magasin pour jusqu’à un mois à température ambiante. Avant de commencer une expérience Remplissez un seau de glace. Prendre une partie aliquote provenant de chacune des 13 réactifs décrites aux points 1.1.1 à 1.1.13 au-dessus et ajoutez-les dans le seau, les gardant ainsi sur la glace. Décongeler à chacun des réactifs avant utilisation. Préparation de microtubulesRemarque : Les Microtubules étaient polymérisés d’une portion de 20 μg de tubuline lyophilisée marqués au colorant. La longueur d’onde d’excitation du colorant est de 647 nm. Préparation de la mémoire tampon la croissance microtubule Pipette 21,8 μL de tampon de BRB80 dans une microcentrifugeuse petite (0,6 mL) tube. Ajouter 1 μL de la solution mère de MgCl2 1 μL de la solution mère de GTP et 1,2 μL de la solution mère de DMSO.Remarque : Ainsi, les concentrations finales des réactifs dans le tampon de BRB80 sont 4 mM MgCl2, 1 mM GTP et diméthylsulfoxyde 5 % (v/v). Polymérisation des microtubules Ajouter 6,25 μL de tampon de croissance de microtubules directement dans une portion de 20 μg de tubuline lyophilisée étiquetée. Vortex l’aliquote de 5 s à 30 rps. Refroidir l’aliquote sur glace pendant 5 min avant l’incubation à 37 ° C pendant 45 min et passez à la section 1.3.3. Stabilisation des microtubules Ajouter 5 μl de solution aliquotés de paclitaxel à 490 μL de tampon de BRB80. Vortex la solution pendant 10 s à 30 rps. Une fois le 45 min d’incubation pour les microtubules sont en hausse, ajouter 5 μl de solution polymérisé microtubules à la solution BRB80/paclitaxel.NOTE : Cette solution de 100 fois les microtubules dilué, stabilisé, va être dénommée MT100. Il peut être utilisé jusqu’à 5 jours, et elle peut être diluée pour obtenir la densité voulue des microtubules pour chaque expérience. Solution de mobilité ATP, ATP à régénération et antifade enzymatique Ajouter 9,0 μL de la solution de la caséine aliquotés à 291 μL de tampon de BRB80. Si la concentration d’ATP désirée pour l’expérience est inférieure à 1 mM, pipette 83 μL de la solution BRB80/caséine dans un nouveau tube de microcentrifuge de 0,6 mL. Sinon, pipette 85 μL de la solution dans un nouveau tube de microcentrifuge de 0,6 mL. Ajouter 1 μL de D-glucose, 1 μL de glucose oxydase, 1 μL de catalase et 1 μL de DTT dans ce tube.NOTE : Ces produits chimiques constituent une enzymatique antifade cocktail21 qui réduiront le Photoblanchiment en enlevant dissous radicaux réactifs de l’oxygène et de trempe. Cela réduit la désintégration photobleaching et microtubules provoquée par l’illumination de l’excitation en fluorescence imaging22,23. Pour des expériences dans lesquelles la concentration d’ATP est choisie pour être sensiblement inférieur à 1 mM, ajouter les réactifs suivants à la solution pour créer un système qui se régénèrent ATP : 1 μL de la solution de phosphate de créatine aliquotés et 1 μL de la créatine aliquotée solution de phosphokinase. Ajoutez 1 μL de la solution mère de l’ATP à la solution de mobilité. Flick ou vortex l’aliquote de façon homogène distribuer les produits chimiques.Remarque : Ainsi, la concentration finale de produits chimiques dans la solution sont 10 μM paclitaxel, 0,5 µg·ml−1 caséine, 20 mM D-glucose, 200 μg·mL−1 glucose oxydase, 8 μg·mL−1 catalase, dithiothréitol 10 mM, 2 mM Créatine phosphate (si ajouté), 2 units· L−1 créatine phosphokinase (si ajouté) et 1 mM d’ATP. Cette solution sera ci-après dénommée la solution de mobilité. KinésineRemarque : La solution de kinésine stock utilisée dans ces expériences est préparée par G. Bachand au centre for Integrated Nanotechnologies à Sandia National Laboratories et mises à disposition sous un contrat d’utilisateur (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). le tampon utilisé ici compose de l’imidazole de 40 mM, 300 mM NaCl, 0,76 g· L-1 EGTA, 37,2 mg· L-1 EDTA, 50 g· Saccharose-1 L et 0,2 mM PTCE μM 50 Mg-ATP. Pour cette série d’expériences, la construction de la kinésine rkin430eGFP a été utilisée. Il s’agit d’une kinésine composé des 430 premiers acides aminés de la chaîne lourde de rat kinésine fusionnée à eGFP et une balise son C-terminal du domaine de queue24. Il a été exprimé chez Escherichia coli et purifiée en utilisant une colonne Ni−NTA. La concentration de la solution mère de GFP-kinésine est 1,8 ± 0,3 μM, telle que déterminée par spectrophotométrie UV/visible, en utilisant un coefficient d’extinction pour GFP de 55 mM-1·cm-1 489 nm25, et compte tenu que la kinésine est un dimère. Déterminer la densité de concentration ou de la surface de kinésine désiré pour l’expérience. Pour les tests typiques, cette concentration est de 20 nM. Si la concentration de kinésine doit être dilué plus d’un centuple, le diluer dans une solution de BRB80 contenant 0.5 µg·ml-1 de la caséine. Ajouter 1 µL de solution de kinésine à la solution de mobilité afin d’obtenir une concentration finale d’environ 20 nM. Microtubules Ajouter 10 μL de la solution de MT100 préparée à la section 1.3 de la solution de mobilité.NOTE : Cette solution de mobilité peut être utilisée jusqu’à 3 heures. Passé ce délai, le système antifade perd de son efficacité car le glucose dans la solution est appauvri par la réaction enzymatique. 2. assembler les cellules d’écoulement Les lamelles de lavage Pour les cellules du flux, utilisez une grande lamelle (dimension : 60 x 25 mm) et un petit (dimensions : 22 x 22 mm)19. Rincez toutes les lamelles couvre-objet deux fois avec de l’éthanol et deux fois avec l’eau ultrapure. Laisser agir les lamelles dans de l’eau ultrapure pour 5 min. faites-les sécher dans une étuve à une température de 50 à 75 ° C. En utilisant un UV/ozone nettoyant (voir Table des matières et des instructions du fabricant), traiter un côté de chaque lamelle pendant 15 min. Effectuez cette étape peut, à la température ambiante (environ 25 ° C) et dans des conditions atmosphériques normales (pression de 1 atm). Tourner délicatement chaque lamelle couvre-objet de l’autre côté (à l’aide de la pince à épiler) et UV/ozone traiter ce côté aussi bien. Laisser agir les lamelles dans de l’eau ultrapure à nouveau pendant 5 minutes avant d’essuyer à nouveau dans le four à une température de 50 à 75 ° C. Traiter les lamelles couvre-objet pour activer la couche PEG-PPG-PEGRemarque : Le diméthyldichlorosilane et le toluène utilisé dans cette partie du protocole étant hautement toxique, effectuez les opérations suivantes sous une hotte aspirante, tout en prenant les précautions suivantes : porter deux séries de gants de protection et une chemise à manches longues sous leur laboratoire manteau. Rentrez les bords des gants à l’intérieur des manches de la chemise pour qu’aucun la peau de l’avant-bras n’est directement exposée aux produits chimiques dans le cas d’un déversement. Porter des lunettes de protection. Diluer 25 mL de pur diméthyldichlorosilane dans 475 mL de toluène. Plongez chaque lamelle couvre-objet dans la solution de diméthyldichlorosilane et toluène pendant 15 secondes. Laver les lamelles deux fois dans le toluène et trois fois dans le méthanol. Sécher les lamelles à l’aide d’azote sous pression. Assemblage des lamelles couvre-objet en cellules d’écoulement Une fois que les lamelles soient secs, coupez un morceau de 2 cm x 2,5 cm de ruban adhésif double-face verticalement en bandes de deux 1 x 2,5 cm. Mettre la grande lamelle sur un essuie-glace de tâche délicate et coller les bandes de ruban adhésif sur la longueur le long des bords de la lamelle couvre-objet pour créer une zone de 1 cm x 2,5 cm entre les morceaux de ruban. Coller la petite lamelle sur le dessus les bandes de ruban adhésif pour terminer l’ensemble de cellule de flux. 3. couler les solutions dans une cellule d’écoulement Approximativement 20 μL de la solution de PEG-PPG-PEG se jettent dans la cellule de flux assemblé. Le volume qui est embarqué dans la cellule doit être assez grand pour remplir la chambre. Dans les étapes suivantes, utilisez le même volume en échangeant les solutions. Permettre la solution PEG-PPG-PEG absorber sur la surface pendant 5 minutes. Échanger la solution PEG-PPG-PEG avec le tampon BRB80 3 fois en coulant le tampon dans. La solution de mobilité se jettent dans la cellule de flux. Sceller les bords de la cellule de flux avec de la graisse pour éviter une évaporation si l’expérience prévue est plu d’une heure.Remarque : La cellule de flux est maintenant prête à être photographié. 4. imagerie de cellules de circulation Effectuer l’imagerie en utilisant une configuration de fluorescence (FRBR) objectif de type réflexion totale interne pour les microtubules et les moteurs de la kinésine (voir Table des matières).NOTE : Ici, nous avons utilisé un microscope avec un x 100 / 1,49 objectif ouverture numérique, à l’aide de deux lasers, avec une longueur d’onde de 642 nm et une puissance maximale de 140 mW et l’autre avec la longueur d’onde de 488 nm et une puissance maximale de 150 mW. Déposez une goutte d’huile à immersion sur l’objectif. Placer la cellule de flux sur la plateforme microscope et amener l’objectif jusqu’à ce qu’il y a contact entre l’huile sur l’objectif et la cellule de flux. Système de couverture pour le verrouillage du microscope permet de bloquer tous les laser lumière de s’échapper. Allumer l’appareil et se concentrer sur la surface inférieure de la cellule de flux. Les microtubules sont fluorescent étiquetés et excitées à une longueur d’onde de 647 nm. Ils sont projetés à l’aide d’un laser à 642 nm alors qu’un laser à 488 nm est utilisé pour les moteurs de GFP-kinésine. Enregistrer les images ou les vidéos d’intérêt. En général, la puissance du laser est d’environ 30 mW et un temps d’exposition de 50 ms pour les deux canaux au laser. Images peuvent être enregistrées pour tant qu’il y a la motilité dans la cellule de flux.Remarque : L’illumination laser est-il dangereux pour le œil nu et peut causer des dommages irréparables. Veuillez vous assurer que la surface éclairée est entièrement recouvert d’un couvercle opaque.