Monteren van moleculaire Shuttles Powered by omkeerbaar aangesloten Kinesins

1. oplossing voorbereiding Let op: Drie van de in dit protocol (tolueen, dimethyldichlorosilane en dithiothreitol) gebruikte reagentia zijn zeer giftig. Raadpleeg de relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) vóór gebruik. Delen van dit protocol moeten bovendien worden uitgevoerd onder een hoger beschermingsniveau, veiligheidsbril en twee sets van beschermende handschoenen dragen, zoals aangegeven. Tenzij anders geadviseerd, kunnen de experimenten worden uitgevoerd op lab banken tijdens het gebruik van alle de passende persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek en schoenen van gesloten-teen). Opmerking: De concentraties van de ATP, kinesin en microtubuli die worden gebruikt in dit protocol kunnen worden aangepast gezien de behoeften van elk experiment. Echter, als gewijzigd, zorg ervoor dat de eindconcentraties van de andere reagentia hetzelfde als in bepaalde blijven hieronder. Alle experimenten werden uitgevoerd bij kamertemperatuur, (~ 25 ° C). Voorbereiding van stamoplossingenOpmerking: Bereiden en aliquot de volgende oplossingen vooraf. Alle aliquots kunnen bereid worden bij kamertemperatuur (~ 25 ° C). BRB80 bufferOpmerking: De buffer voor de meeste van de oplossingen die in dit protocol worden gebruikt is BRB80. BRB80 kan worden bereid in grote hoeveelheden en opgeslagen in een vriezer van-20 ° C. Los 24.2 g van piperazine-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (buizen) en 3.1 g van kaliumhydroxide (KOH) in 800 mL in gedeïoniseerd water om 800 mL 100 mM buizen. 100 mL 10 mM magnesiumchloride (MgCl2) en 100 mL 10 mM ethyleen glycol Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA) te krijgen een eindvolume van 1 L. Raising pH 8 met kaliumhydroxide (KOH) kan helpen bij de ontbinding van de buizen en de EGTA toevoegen.Opmerking: De eindconcentraties van chemische stoffen in de buffer van de BRB80 zijn 80 mM buizen, 1 mM MgCl2en 1 mM EGTA. Breng de pH van de buffer 6.9 met behulp van KOH en zoutzuur (HCl). ATP Bereid een 1 mL oplossing van 100 mM ATP in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer-80 ° C. GTP Bereid een 500 μL oplossing van 25 mM GTP in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 5 μl aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer-80 ° C. MgCl2 Bereid een 1 mL oplossing van 100 mM MgCl2 in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C. Caseïne Weeg 1 g van droge caseïne en overbrengen naar een tube van 50 mL conische centrifuge. 35 mL BRB80 buffer aan de buis te ontbinden de caseïnepoeder toevoegen. Plaats de oplossing in een tumbler in een koude kamer te ontbinden ‘s nachts. De oplossing ziet er op dit punt, voor dik en viskeus is. Laat de buis rechtop in een koelkast 4 ° C te voorzien in een grote onopgeloste bosjes te regelen. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis. Draai de buis in een centrifuge op 1.000 x g tot pellet uit meer precipitaten. Nogmaals, het supernatant naar een nieuwe buis overbrengen. Herhaaldelijk Filtreer de oplossing met behulp van 0,2 micrometer (7 bar maximale druk) filters. De oplossing wordt dik, veel filters zal verstopt raken, dus Herhaal deze stap totdat het filter duidelijk is en unclogged. Bepaal de concentratie van de caseïne in de resulterende oplossing om met UV/Vis-spectrofotometrie, met behulp van caseïne van uitsterven coëfficiënt van 19 mM-1∙cm-1 op 280 nm20. Ervan uitgaande dat een moleculair gewicht van 23 kDa voor caseïne, Verdun de oplossing tot een concentratie van 20 mg∙mL-1 in BRB80. Pipetteer de oplossing in 20 μL aliquots en de aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C. D-Glucose Bereid een 1 mL oplossing van 2 M D-glucose in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C. Glucose-oxidase Bereid een 1 mL oplossing van 20 mg∙mL-1 glucose-oxidase in BRB80. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C. Katalase Bereid een 1 mL oplossing van 0.8 mg∙mL-1 katalase in BRB80. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C. Dithiothreitol (DTT)Opmerking: Aangezien DTT iets vluchtige en giftige is, voer de volgende stappen uit onder een zuurkast. Bereid een 1 mL oplossing van 1 M DTT in ultrazuiver water verdund. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C. Paclitaxel Bereid een 1 mL oplossing van 1 mM paclitaxel verdund in DMSO. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C. Dimethylsulfoxide (DMSO)Opmerking: De DMSO gebruikt in deze experimenten is puur. Pipet 1 mL puur DMSO in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C. Creatine fosfaat Bereid een 1 mL oplossing van 0,2 M creatine fosfaat in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C. Creatine phosphokinase Bereid een 1 mL oplossing van 200 units· L-1 creatine phosphokinase in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C. Nikkel (II) sulfaat 500 mL van een oplossing van 50 mM nikkel (II) sulfaat in ultrazuiver water voor te bereiden. Bewaar de oplossing op kamertemperatuur (~ 25 ° C). Poly(Ethylene glycol)-blok-poly(propylene glycol)-blok-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) oplossing Weeg 2 mg PEG-PPG-PEG (nummer gemiddeld molecuulgewicht: 14.600 g∙mol-1)-NTA poeder op het gewicht van papier. PEG-PPG-PEG-NTA is de triblock-copolymeer matiemaatschappij met een nitrilotriacetic zuur (NTA) groep. Verwijzen naar de Tabel van materialen voor meer informatie over de PEG-PPG-PEG-NTA. Breng het poeder in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. 1 mL van de stockoplossing van nikkel (II) sulfaat toevoegen aan de buis. Vortex tot poeder is opgelost en geen zichtbare bosjes blijven. Winkel voor maximaal een maand bij kamertemperatuur. Voordat u begint een experiment Vul een emmer met ijs. Neem één monster uit elk van de 13 reagentia beschreven in de punten 1.1.1 tot en met 1.1.13 boven en voeg ze toe aan de emmer, dus houden ze op het ijs. Ontdooi elk van de reagentia vóór gebruik. Microtubulus voorbereidingOpmerking: Microtubuli waren polymeervorm van een 20 μg hoeveelheid kleurstof-geëtiketteerden gelyofiliseerd tubuline. De golflengte van de excitatie van de kleurstof is van 647 nm. Voorbereiding van de microtubuli groei buffer Pipetteer 21,8 μL van BRB80 buffer in een klein (0,6 mL)-microcentrifuge buis. 1 μL van de stockoplossing van MgCl2 , 1 μL van de stockoplossing van GTP en 1.2 μL van de stockoplossing van DMSO toevoegen.Opmerking: De eindconcentraties van de reagentia in de buffer van de BRB80 zijn dus 4 mM MgCl2, 1 mM GTP en 5% (v/v) dimethylsulfoxide. Microtubuli polymerisatie Voeg 6,25 μL van microtubulus groei buffer direct in een hoeveelheid van 20 μg van gelabelde gelyofiliseerd tubuline. Vortex het afgepipetteerde deel voor 5 s bij 30 rps. Koel het afgepipetteerde deel op het ijs gedurende 5 minuten vóór het incuberen bij 37 ° C gedurende 45 minuten en gaat u verder met sectie 1.3.3. Microtubulus stabilisatie Voeg toe 5 μL van de oplossing aliquoted paclitaxel aan 490 μL van BRB80 buffer. Vortex de oplossing voor 10 s bij 30 rps. Zodra de 45 min van incubatie gedurende de microtubuli zijn up, toevoegen 5 μL van de gepolymeriseerde microtubulus-oplossing aan de BRB80/paclitaxel oplossing.Opmerking: Deze oplossing 100-fold verdunde, gestabiliseerd, microtubulus zal worden hierna MT100. Het kan tot maximaal 5 dagen worden gebruikt, en het kan worden verdund om te verkrijgen van de gewenste microtubulus-dichtheid voor elk experiment. Motility oplossing Enzymatische antifade, ATP regenereren systeem en ATP 9.0 μL van de aliquoted caseïne-oplossing toevoegen aan 291 μL van BRB80 buffer. Als de gewenste concentratie van het ATP voor het experiment lager dan 1 mM, Pipetteer 83 μL van de BRB80/caseïne-oplossing in een nieuwe 0,6 mL microcentrifuge buis is. Anderszins, Pipetteer 85 μL van die oplossing in een nieuwe 0,6 mL microcentrifuge buis. Voeg 1 μL van D-glucose, 1 μL van glucose-oxidase, 1 μL van katalase en 1 μL van DTT aan die buis.Opmerking: Deze chemische stoffen vormen een enzymatische antifade cocktail21 die photobleaching verminderen door het verwijderen van zal opgeloste zuurstof en blussen reactieve radicalen. Dit vermindert photobleaching en microtubulus desintegratie, veroorzaakt door de verlichting van de excitatie tijdens fluorescentie22,23imaging. Experimenten waarin de ATP-concentratie wordt gekozen aanzienlijk lager is dan 1 mM, voegt toe de volgende reagentia aan de oplossing voor het maken van een ATP-regenereren-systeem: 1 μL van de oplossing aliquoted creatine fosfaat en 1 μL van de aliquoted creatine phosphokinase de oplossing. 1 μL van de stockoplossing van ATP toevoegen aan de oplossing van de motiliteit. Flick of vortex het afgepipetteerde deel homogeen verdelen de chemische stoffen.Opmerking: De uiteindelijke concentratie van chemische stoffen in de oplossing zijn dus 10 μM paclitaxel, 0.5 mg·mL−1 caseïne, 20 mM D-glucose, 200 μg·mL−1 glucose oxidase, 8 μg·mL−1 katalase, dithiothreitol van 10 mM, 2 mM creatine fosfaat (als toegevoegd), 2 units· L−1 creatine phosphokinase (als toegevoegd), en 1 mM ATP. Deze oplossing zal worden hierna te noemen de motiliteit oplossing. KinesinOpmerking: De voorraad kinesin-oplossing gebruikt bij deze experimenten is voorbereid door G. vrijgezel in het midden voor geïntegreerde nanotechnologieën op Sandia National Laboratories en beschikbaar gesteld onder een gebruikersovereenkomst (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). de buffer gebruikt hier bestaat uit 40 mM imidazool, 300 mM NaCl, 0,76 g· L-1 EGTA, 37.2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 sacharose, 0,2 mM TCEP en 50 μM Mg-ATP. Voor deze serie van experimenten, werd de structuur van de kinesin van de rkin430eGFP gebruikt. Dit is een kinesin bestaande uit de eerste 430 aminozuren van rat kinesin zware ketting gesmolten eGFP en een C-terminal zijn-tag op de staart domein24. Het kwam tot uitdrukking in Escherichia coli en gezuiverd met behulp van een Ni−NTA kolom. De concentratie van de stockoplossing GFP-kinesin was 1.8 ± 0,3 μM zoals bepaald door UV/Vis-spectrofotometrie, met behulp van een aanpassingscoëfficiënt vast die uitsterven voor GFP van 55 mM-1•cm-1 op 489 nm25, en rekening houdend met die kinesin is een dimeer. Bepalen de gewenste kinesin concentratie of oppervlak dichtheid voor het experiment. Deze concentratie is voor typische testen, 20 nM. Als de concentratie van de kinesin moet worden verdund moet meer dan een awreken, het verdund in een oplossing van BRB80 dat 0,5 mg·mL-1 voor caseïne bevat. Voeg 1 µL van kinesin oplossing aan de motiliteit oplossing om een eindconcentratie van ongeveer 20 nM. Microtubuli Voeg toe 10 μL van de MT100 oplossing bereid in punt 1.3 tot de oplossing van de motiliteit.Opmerking: Deze beweeglijkheid oplossing kan worden gebruikt voor maximaal 3 uur. Na die tijd verliest het antifade systeem zijn doeltreffendheid aangezien de glucose in de oplossing is uitgeput door de enzymatische reactie. 2. monteren van de stroom-cellen Wassen van de coverslips Voor stroom cellen, gebruikt u een grote dekglaasje aan (dimensie: 60 x 25 mm) en een kleine (afmetingen: 22 x 22 mm)19. Spoel alle coverslips tweemaal met ethanol en tweemaal met ultrazuiver water. Bewerk de ultrasone trillingen ten de coverslips in ultrazuiver water voor 5 min. ze drogen in een oven bij een temperatuur van 50-75 ° C. Met behulp van een UV/ozon schoner (Zie Tabel van materialen en aanwijzingen van de fabrikant), behandeling van één zijde van elke dekglaasje aan voor 15 min. deze stap kunt uitvoeren, bij kamertemperatuur (~ 25 ° C) en in normale atmosferische toestand (druk van 1 atm). Zorgvuldig zet elke dekglaasje aan naar de andere kant (met pincet) en UV/ozon behandelen die kant ook. Bewerk ultrasone trillingen ten de coverslips in ultrazuiver water opnieuw gedurende 5 minuten vóór het drogen ze opnieuw in de oven bij een temperatuur van 50-75 ° C. Behandeling van de coverslips om te schakelen van PEG-PPG-PEG coatingOpmerking: De dimethyldichlorosilane en de tolueen gebruikt in dit deel van het protocol wordt zeer giftig, volgt onder een zuurkast, terwijl de volgende voorzorgsmaatregelen nemen: het dragen van twee sets van beschermende handschoenen en een lange mouwen shirt onder hun lab vacht. Plooi de randen van de handschoenen in de mouwen van het shirt zodat geen huid van de onderarmen rechtstreeks aan de chemische stoffen die in het geval van een morsen blootstaat. Beschermende bril. Verdun 25 mL van pure dimethyldichlorosilane in 475 mL tolueen. Elke dekglaasje aan in de dimethyldichlorosilane en tolueen oplossing onderdompelen gedurende 15 seconden. Wassen de coverslips tweemaal in tolueen en drie keer in methanol. Droog de coverslips met behulp van hydrofoor stikstof. Montage van coverslips in cellen van de stroom Zodra de coverslips droog zijn, snij een 2 x 2,5 cm stukje dubbelzijdig tape verticaal in twee 1 x 2,5 cm strepen. De grote dekglaasje aan zetten de Wisser van een delicate taak en plak de tape strepen in de lengte langs de randen van het dekglaasje aan een 1 x 2,5 cm ruimte tussen de stukjes tape te creëren. Plak de klein dekglaasje aan op de top van de strepen van de band tot het einde van de vergadering van de cel van de stroom. 3. stroomt de oplossingen in een flow-cel Stroom ongeveer 20 μL van de PEG-PPG-PEG-oplossing in de cel geassembleerde stroom. Het volume dat is gevlogen in de cel moet groot genoeg zijn om de kamer te vullen. In de volgende stappen gebruiken hetzelfde volume als de oplossingen uit te wisselen. Zorgen voor de oplossing van de PEG-PPG-PEG te vangen op het oppervlak voor 5 minuten. De PEG-PPG-PEG-oplossing met BRB80 buffer 3 keer langs stroomt de buffer in uitwisselen. De motiliteit oplossing uitmonden in de cel van de stroom. Het zegel van de randen van de cel van de stroom met vet om te voorkomen dat de verdamping, als de geplande experiment langer dan een uur is.Opmerking: De stroom-cel is nu klaar om te worden beeld. 4. imaging een stroom-cel Het uitvoeren van de beeldvorming die met behulp van een doelstelling-type totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) setup voor zowel de microtubuli, en de motoren van de kinesin (Zie Tabel van materialen).Opmerking: Hier, we gebruikten een microscoop met een 100 x / 1,49 de lens van de doelstelling van het numerieke opening, met behulp van twee lasers, één met een golflengte van 642 nm en een maximaal vermogen van 140 mW, en een ander met een golflengte van 488 nm en een maximumvermogen van 150 mW. Breng een druppel van immersie-olie op het doel. Plaats van de cel van de stroom op het platform van de Microscoop en brengen de doelstelling tot er contact tussen de olie op het doel en de stroom-cel is. Gebruik van de Microscoop vergrendeling cover systeem voor het blokkeren van alle laserlicht ontsnappen. Zet de laser en zich richten op het onderste oppervlak van de cel van de stroom. De microtubuli fluorescently zijn geëtiketteerd en opgewonden bij een golflengte van 647 nm. Zij zal worden beeld met behulp van een 642 nm laser terwijl een 488 nm laser wordt gebruikt voor het GFP-kinesin motoren. Het opnemen van de beelden of video’s van belang. De kracht van de laser is meestal ongeveer 30 mW en een belichtingstijd van 50 ms voor zowel laser kanalen. Beelden kunnen opgenomen worden voor zolang er beweeglijkheid in de cel van de stroom.Opmerking: De laser verlichting is schadelijk voor het blote oog en kan onherstelbare schade veroorzaken. Gelieve ervoor te zorgen dat de verlichte gebied volledig met een ondoorzichtige deksel bedekt is.