由可逆连接的运动素提供动力的分子穿梭机的组装

1. 解决方案准备 注意: 本协议中使用的三种试剂 (甲苯、二甲基二氯硅烷和二硫代三醇) 毒性很强。使用前, 请参考相关材料安全数据表 (msds)。此外, 该协议的部分内容需要在更高水平的保护下进行, 如图所示, 戴着安全眼镜和两套防护手套。除非另有建议, 实验可以在实验室的长椅上进行, 同时使用所有适当的个人防护设备 (安全眼镜、手套、实验室外套、全长裤子和闭脚鞋)。 注: 本协议中使用的 atp、动蛋白和微管的浓度可以根据每个实验的需要进行修改。但是, 如果进行了改性, 请确保其他试剂的最终浓度保持与以下相同。所有实验均在室温 (~ 25°c) 下进行。 库存解决方案的准备注: 事先准备好以下解决方案。所有的等价物均可在室温 (~ 25°c) 下制备。 brb80 缓冲器注: 此协议中使用的大多数解决方案的缓冲区都是 brb80。brb80 可大量制备, 并存储在-20°c 的冰柜中。 在去离子水中溶解24.2 克哌嗪-n、n ‘-bis(2-乙氨酸) (ipes) 和3.1 克氢氧化钾 (koh), 使其达到800毫升 100 mm 的管道。加入100毫升的 10 mm 氯化镁 (mgcl2) 和100毫升的 10 mL 乙二醇四乙酸 (egta), 以获得1升的最终体积, 用氢氧化钾 (koh) 将 ph 值提高到 8, 有助于 pipes 和 egta 的溶解。注: brb80 缓冲液中的化学品最终浓度为 80 mm 管、1 mm mgcl2和 1 mm egta。 使用 koh 和盐酸 (hcl) 将缓冲液的 ph 值调整到6.9。 Atp 在超纯水中制备 100 mL atp 的 1 ml 溶液。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-80°c 的冰柜中。 gtp 在超纯水中制备 25mm gtp 的500μl 溶液。将溶液移入5μl 的等价物。将等价物存放在-80°c 的冰柜中。 mgcl2 在超纯水中制备 100 mm mgcl 2的 1 ml 溶液。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。 酪 蛋白 称量1克干酪蛋白, 并将其转移到50毫升的锥形离心管中。在试管中加入35毫升 brb80 缓冲液, 溶解酪蛋白粉。 将溶液放入冷室的翻滚器中, 以便在夜间溶解。此时, 溶液看起来又厚又粘稠。 将管子垂直放在4°c 的冰箱中, 以便能够解决任何未溶解的大型团块。将上清液转移到新管中。 在 1, 000 x克的离心机中旋转管道, 以产生更多的沉淀物。再次, 转移到一个新的管上清液。 使用 0.2μm (最大压力) 过滤器重复过滤溶液。解决方案较厚, 许多筛选器将被堵塞, 因此请重复此步骤, 直到筛选器清除并未堵塞。 使用 uv/vis 分光光度法测定得到的溶液中酪蛋白浓度, 使用酪蛋白的消光系数为 19 mm-1 * cm-1 , 在 280 nm20.假设酪蛋白的分子量为 23 kda, 则将溶液稀释到 brb80 中20毫克·ml-1的浓度。 将溶液放入20μl 的等价物, 并将其存放在-20°c 的冷冻机中。 d-葡萄糖 在超纯水中制备 2 m d-葡萄糖的 1 ml 溶液。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。 葡萄糖氧化酶 在 brb80 中制备20毫克 * ml-1葡萄糖氧化酶的1毫升溶液。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。 过氧化氢 酶 在 brb80 中制备0.8 毫克的1毫升溶液 * ml-1 过氧化氢酶。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。 二硫醇 (dtt)注: 由于 dtt 具有轻微的挥发性和毒性, 请在通风罩下执行以下步骤。 制备在超纯水中稀释的 1m dtt 溶液1毫升。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。 紫杉 醇 制备在 dmso 中稀释的 1 mm 紫杉醇的1毫升溶液。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。 二甲基亚硫醚 (dmso)注: 这些实验中使用的 dmso 是纯的。 将纯 dmso 的皮包1毫升放入 10μl aliquots。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。 磷酸肌酸 在超纯水中制备 0.2 m 磷酸肌酸酯的1毫升溶液。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。 肌酸磷酸激酶 准备一个1毫升的解决方案, 200 单位·l-1肌酸磷酸激酶在超纯水中的作用。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。 硫酸镍 (ii) 在超纯水中制备 50 mm 镍 (ii) 硫酸盐溶液500毫升。将溶液存放在室温 (~ 25°c)。 聚乙二醇-块状聚 (丙二醇)-块状聚乙二醇 (乙二醇) (聚乙二醇) (聚乙二醇) 溶液 称重2毫克的 peg-pwg-peg (平均分子量:14 600 g/m·mol-1)-nta 粉末在称重纸上。聚乙二醇-pwg-peg-nta 是用硝酸乙酸 (nta) 组功能化的三块共聚物。有关 peg-ppg-peg-nta 的更多详细信息, 请参阅材料表。 将粉末转移到 1.5 ml 微离心管中。在管中加入1毫升的库存镍 (ii) 硫酸盐溶液。涡旋, 直到粉末被溶解, 没有可见的团块仍然存在。 在室温下存放长达一个月。 在开始实验之前 在水桶里装满冰。 从1.1.1 节中描述的13种试剂中的每一种试剂中取一个, 1.1.13 上面的, 并将它们添加到桶中, 从而将它们保持在冰上。使用前解冻每种试剂。 微管制备注: 微管由染料标记冻干小管蛋白的20μg 脂肪聚合而成。染料的激发波长为647纳米。 微管生长缓冲液的制备 将21.8μl 的 brb80 缓冲液注入小型 (0.6 ml) 微离心管。加入 1μl的mgcl 2 库存溶液、1μl 的 gtp 库存溶液和1.2μl 的 dmso 库存溶液。注: 因此, brb80 缓冲液中试剂的最终浓度为 4 mm mgcl2、1 mm gtp 和 5% (v/v) 二甲基亚硫酸盐。 微管聚合 将6.25μl 的微管生长缓冲液直接加入到标记冻干管蛋白的20μg 的脂肪中。在 30 rps 的情况下, 旋转 5 s 的 aliquot。 将脂肪在冰上冷却 5分钟, 然后在37°c 孵育 45分钟, 然后进行切片1.3.3。 微管稳定 在490μl 的 brb80 缓冲液中加入5μl 的紫杉醇溶液。以 30 rps 的速度旋转10秒的解决方案。 一旦微管的培养时间达到 45分钟, 将聚合微管溶液的5μl 添加到 brb80/aclitaxel 溶液中。注: 这种100倍稀释、稳定的微管溶液将被称为 mt100。它最多可以使用 5天, 并且可以稀释, 以获得每个实验所需的微管密度。 动力解决方案 酶抗褪色、atp 再生系统和 atp 在291μl 的 brb80 缓冲液中加入9.0μl。 如果实验所需的 atp 浓度低于 1 mm, 将 BRB80/casein 溶液的吡管83μl 注入新的 0.6 ml 微离心管。否则, 将该溶液的液槽85μl 放入新的 0.6 ml 微离心管中。 在该管中加入1μl 的 d-葡萄糖、1μl 的葡萄糖氧化酶、1μl 的过氧化氢酶和1μl 的 dtt。注: 这些化学物质构成了酶抗褪色鸡尾酒21 , 它将通过去除溶解氧和淬火反应自由基来减少光漂白。这减少了荧光成像 22,23 过程中激发照明引起的光漂白和微管崩解。 对于选择 atp 浓度明显低于 1 mm 的实验, 在溶液中加入以下试剂以创建 atp 再生系统: 1 微米的脂肪酸磷酸肌酸溶液和1微米的外代肌酸磷酸激酶溶液。 在动力溶液中加入1μl 的库存 atp 溶液。轻拍或旋涡的脂肪, 以均匀地分布的化学品。注: 因此, 溶液中化学物质的最终浓度为10μm 紫杉醇, 0.5 mg·ml-1 酪蛋白 , 20 mm d-葡萄糖, 200μg·ml-1 葡萄糖氧化酶, 8μg·ml-1 过氧化氢酶, 10 mL二硫醇, 2 mm 磷酸肌酸 (如果添加), 2单位·l-1肌酸磷酸激酶 (如果添加) 和 1 mm atp。此解决方案将在以下情况下称为动力解决方案。 基内辛注: 这些实验中使用的库存动力学溶液由 g. bachand 在桑迪亚国家实验室综合纳米技术中心制备, 并根据用户协议 (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php) 提供, 此处使用的缓冲液包括40毫米咪唑、300 mm 氯化钠、0.76 克·l-1 egta, 37.2 毫克·l-1 edta, 50 克·l-1蔗糖, 0.2 mm tcep 和 50μm mg-atp。在这一系列实验中, 采用了 rkin430eGFP 因子结构。这是一种由首批430种大鼠在重链中的氨基酸和在尾部24融合的 c 端 hh 标记组成的激素.它在大肠杆菌中表达, 并使用镍-nta 柱纯化。采用55mm-1 · cm-1 在 489 nm 25 下的 gfp-1·mgle-1 的 gfp 消光系数, 并考虑到近年来素是二聚体, 用 uv/vis 分光光度法测定, gfp-激素素的库存溶液浓度为 1.8±0.3μm. 确定实验所需的因子浓度或表面密度。对于典型的检测, 这种浓度为 20 nm。如果动素浓度需要稀释一百倍以上, 则在含有 0.5 mg·ml-1 酪蛋白的 brb80 溶液中稀释. 在运动溶液中加入1μl 的动力溶液, 以获得约 20 nm 的最终浓度。 微 在运动溶液中加入第1.3 节中制备的 mt100 溶液的10μl。注: 此动力解决方案最多可以使用3小时。之后, 防褪色系统失去其有效性, 因为溶液中的葡萄糖被酶反应耗尽。 2. 组装流动单元 清洗盖板 对于流动单元, 使用大盖板 (尺寸:60 毫米 x 25 毫米) 和小盖板 (尺寸:22 毫米 x 22 毫米)19。 用乙醇冲洗两次, 用超纯水冲洗两次。将盖板在超纯水中涂成 5分钟, 在50–75°c 的温度下, 在烤箱中干燥。 使用 uv/臭氧清洁剂 (见材料表和制造商的说明), 对每个盖板的一侧进行15分钟的处理, 在室温 (~ 25°c) 和正常大气条件 (1 atm 的压力) 下执行此步骤。 小心地将每个盖板转向另一侧 (使用子), uv/臭氧也会治疗这一边。 将盖板再次在超纯水中涂布 5分钟, 然后在50–75°c 的温度下再次在烤箱中干燥。 处理盖板, 使聚乙二醇-pwg-peg 涂层注: 本协议这一部分使用的二甲基二氯硅烷和甲苯具有剧毒性, 在烟罩下执行以下步骤, 同时采取以下预防措施: 在其实验室内佩戴两套防护手套和一件长袖衬衫外套。将手套的边缘塞入衬衫的袖子内, 以便在溢出的情况下, 前臂的皮肤不会直接暴露在化学物质中。戴上防护眼镜。 在475毫升甲苯中稀释25毫升纯二甲基。将每个盖板浸泡在二甲基二氯硅烷和甲苯溶液中15秒。 用甲苯清洗两次盖板, 在甲醇中清洗三次。使用加压氮气擦干盖板。 将覆盖物组装成流动细胞 一旦盖板干燥, 将2厘米 x2.5 厘米的双面胶带垂直切割成两条1厘米 x2.5 厘米的条纹。 将大型盖板放在一个精致的任务雨刮器上, 并沿盖板边缘纵向贴胶带条纹, 在胶带碎片之间创建一个1厘米 x 2.5 厘米的区域。 将小盖板贴在胶带条纹的顶部, 完成流动单元组件。 3. 将溶液流入流动单元 将聚乙二醇-pwg-peg 溶液的流动约20μl 流入组装的流动单元。在电池中飞行的体积必须足够大, 以填充房间。在接下来的步骤中, 在交换解决方案时使用相同的卷。 允许聚乙二醇-pwg-peg 溶液在表面吸收5分钟。将 peg-pwg-peg 溶液与 brb80 缓冲液交换 3次, 将缓冲液流经。将运动液流动到流动细胞中。 如果计划的实验超过一小时, 请用润滑脂密封流动细胞的边缘, 以防止蒸发。注: 流单元现在已准备好进行映像。 4. 成像流动单元 使用目标型全内部反射荧光 (tirf) 设置对微管和电机运动进行成像 (见材料表)。注: 在这里, 我们使用了带有100x/1.49 数字孔径物镜的显微镜, 使用了两个激光器, 一个波长为 642 nm, 最大功率为 140 mw, 另一种波长为 488 nm, 最大功率为 150 mw。 在目标上放置一滴浸入式油。 将流动细胞放置在显微镜平台上, 并将目标提高到目标上的油与流动细胞之间的接触。 使用显微镜的联锁覆盖系统阻止所有激光泄漏。 打开激光, 将注意力集中在流动细胞的下表面。微管在647纳米的波长下进行荧光标记和激发。他们将使用642纳米激光成像, 而488纳米激光用于 gfp-运动素电机。 录制感兴趣的图像或视频。通常情况下, 两个激光通道的激光功率约为 30 mw, 曝光时间为50毫秒。只要流动单元有运动, 就可以记录图像。注: 激光照明对肉眼有害, 可造成无法弥补的损害。请确保照明区域完全覆盖着不透明的盖子。