Identificatie van nieuwe CK2 Kinase substraten met behulp van een veelzijdige benadering van de biochemische
Summary
De doelstelling van dit protocol is label, verrijken en identificeren van substraten voor proteïne kinase CK2 uit een complexe biologische monster zoals een cel lysate of weefsel homogenaat. Deze methode maakt gebruik van unieke aspecten van CK2 biologie voor dit doel.
Abstract
De studie van kinase-substraat relaties is essentieel voor een compleet begrip van de functies van deze enzymen en hun downstream doelen in zowel fysiologische en pathologische staten krijgen. CK2 is een evolutionair geconserveerde serine/threonine kinase met een groeiende lijst van honderden substraten die betrokken zijn bij meerdere cellulaire processen. Wegens zijn pleiotropic eigenschappen, is identificatie en karakterisering van een uitgebreide set van CK2 substraten bijzonder uitdagende en blijft een hindernis in de studie van dit belangrijke enzym. Om aan deze uitdaging, hebben we een veelzijdige experimentele strategie waarmee de gerichte verrijking en identificatie van vermeende CK2 substraten bedacht. Dit protocol maakt gebruik van de specificiteit van de unieke dual co substraat van CK2 rekening houdend met de specifieke thiophosphorylation van de substraten in een cel of een weefsel lysate. Vervolgens worden deze eiwitten substraat Gealkyleerde, immunoprecipitated, en geïdentificeerd door vloeibare chromatografie/tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). Wij hebben vroeger deze aanpak succesvol identificeren CK2 substraten van Drosophila eierstokken en hier verlengen we de toepassing van dit protocol aan menselijke glioblastoma cellen, ter illustratie van het aanpassingsvermogen van deze methode te onderzoeken de Biologische rol van deze kinase in verscheidene modelorganismen en experimentele systemen.
Introduction
Eiwit kinases zijn belangrijke componenten voor signaaltransductie cascades. Fosforylering van substraat eiwitten door deze enzymen lokt biologische reacties die kritieke gebeurtenissen controleren celdeling, metabolisme en differentiatie, o.a. regelen. CK2 is een acidophilic, overal die zich uiten serine/threonine kinase dat is geconserveerd uit gist bij de mens en dat speelt belangrijke rol in veel cellulaire processen variërend van transcriptionele verordening tot celcyclus aan apoptosis1 ,2,3. Het enzym is een heterotetramer samengesteld uit twee katalytische α (of α’) subeenheden en twee regelgevende β-subunits4. Naast het feit dat zeer pleiotropic, vertoont CK2 twee andere ongebruikelijke kenmerken die haar analyse bemoeilijken, namelijk constitutieve activiteit5 en dubbele co substraat specificiteit6. Deze laatste eigenschap schenkt CK2 met de mogelijkheid om gebruik van GTP evenals ATP voor fosforylering van eiwitten van het substraat.
Genetische schrapping van de katalytische of regelgevende subeenheden van CK2 in muizen resulteert in embryonale letaliteit die aangeeft dat het een cruciale rol tijdens het ontwikkelen en organogenese7,8 speelt. CK2 is ook overexpressie in verschillende soorten kanker en vormt aldus een veelbelovend therapeutisch doel9,10,11. Inderdaad, specifieke remmers dat doel CK2 kinaseactiviteit momenteel onderzochte voor dit doel12,13,14. Terwijl remming van CK2 een haalbare optie is, gezien het pleiotropic karakter, een alternatief en misschien meer rationele benadering zou moeten richten op kritische CK2 substraten die ten grondslag liggen aan de voortgang van bepaalde kankers. Daarom zou de uitvoerige identificatie en karakterisering van CK2 substraat eiwitten aanzienlijk voordeel voor het ophelderen van de specifieke functie (s) van deze kinase binnen een bepaald weefsel of tumor type.
Hier beschrijven we een veelzijdige biochemische methode voor het identificeren van CK2 substraten uit een complexe biologische monster zoals een cel of een weefsel lysate. Dit protocol maakt gebruik van de specificiteit van de dubbele co substraat van CK2 door gebruik van de GTP analoge GTPγS (calciumguanosine 5′-[γ-thio]triphosphate) die andere endogene kinases niet kunnen gebruiken. Hierdoor kunnen effectief de kinase “label” haar substraten binnen dit voorbeeld voor latere isolatie en identificatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een relatief eenvoudige biochemische methode voor het identificeren van substraten voor proteïne kinase CK2 uit een complexe biologische monster. De kritische stappen van dit protocol zijn gebaseerd op de ongewone enzymatische eigenschappen van CK2 en bevatten CK2-afhankelijke thiophosphorylation van specifieke substraat eiwitten met behulp van GTPγS en hun latere immunoprecipitation en identificatie. Met deze resultaten hebben wij het nut en de veelzijdigheid van deze aanpak aangetoond zoa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk gesteund door een subsidie van de Commonwealth universele onderzoek verbetering van het ministerie van volksgezondheid van Pennsylvania naar T.I.S.
Materials
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
