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Biochemistry

完全自律型の特性と生体高分子の結晶からのデータ収集

Published: March 22, 2019
doi:
10.3791/59032
, , , , ,
1Structural Biology Group,European Synchrotron Radiation Facility, 2Grenoble Outstation,European Molecular Biology Laboratory

Summary

ここでは、いくつかの放射光ビームラインで自動スクリーニングおよびデータ コレクションは、使用可能なオプションを使用する方法をについて説明します。科学者が、放射光に冷凍サンプルを送る回折特性を上映、データ セットが収集および処理し、構造解析は実施可能であれば、-すべての人間の介入なし。

Abstract

オートメーションと相まって高輝度 x 線ビームは、構造生物学でも最も挑戦的なプロジェクトのための放射光を用いた生体高分子 x 線結晶構造解析 (MX) ビームラインの使用につながっています。ただし、ほとんどの施設はまだ実験を実行するサイトの科学者の存在を必要です。新世代の全自動特性評価とから、データを収集する専用のビームラインを自動の生体高分子の結晶は最近開発されました。これらのビームラインは、ユーザー自身のビームラインを制御することのない初期結晶化試験および/または多数の回折データ セットのコレクションの結果を画面に構造生物学者のための新しいツールを表します。自動スクリーニングおよびデータの収集のための実験を設定する方法を示すどのビームラインで実験を実行すると、結果のデータ セットの処理方法、および方法については、可能な場合、生体高分子の結晶構造は解決。

Introduction

特定の蛋白質の三次元構造を決定するは、生物学で重要です。やってから派生する情報は、光生物学的機能、形状、調査の下で分子に含まれているアクティブ/結合サイトの特異性を投げかけています。多くの場合、これにより決定されるまたは、適切な場合、作用機序潜在的な治療上の分子を開発します。MX は構造情報を取得する最も一般的に使用される手法が、ボトルネックよく回折結晶を取得する最適の条件の決定であります。したがって、結晶化試験は多数の異なる条件で行われている、回折データ収集に使用される最高の結晶を見つけるにして上映されます。結晶化試験1のセットアップの自動化はこの点で明らかにしました。ただし、後続のステップ (すなわち、結晶のマウント、回折検査と回折データ収集) 通常遂行される手動で、時間、労力、およびリソースの多くを占めてします。回折のスクリーニングおよびデータ収集の自動化は、時間と効率の利得の巨大なを意味する、したがって。

MX で回折スクリーニングおよびデータ コレクション最も頻繁の自動化はこのプロセスを促進している主 MX 放射光ビームラインで実行されます。しかし、ほとんどのケースでは、科学者は実験中にビームラインに存在するまたはリモートでそれを動作するように必要です。最近、完全に自動化された MX ビームラインの新しい生成は開発2をしています。ここでは、ユーザーは、存在する、物理的にまたはリモートで実験的セッション中には必要ありません。これにより科学者支出全体の日ではなく、多くの場合より少ない日常的なタスクに費やす時間を夜、スクリーニング結晶回折データを収集。世界の最初の完全に自動化されたビームラインは超自動サンプル選択統合機能 (山地-1、ID30A-1)2,3ヨーロッパ シンクロトロン放射光施設 (ESRF) で。大容量サンプルを含むデュワーのビームラインの計4,5としても機能するロボット検体チェンジャーとタンデムで動作するユニークなサンプル環境があります。山地 1 が装備されて、単一光子計数ハイブリッド ピクセル検出器6、固定波長 0.969 で動作するアンジュレータ ビームライン Å (12.84 keV) 強烈な x 線ビーム (2 x 1012光子/秒) を持つ。サンプル位置でのビーム径は 100 μ x 65 μ m (水平垂直ビームサイズ、) 最大 10 μ m (円形ビーム) の最小値と調整できます。平均では、ビームラインことができますプロセスは、完全に自動で 24 h で (下記参照)、120 結晶のファッションします。ビームラインの操作は、ワークフローの7、インテリジェントな意思決定のワークフローでは、前の手順の結果に基づく調査の下でサンプルからの最高の可能なデータの測定を確保するためは、それぞれのシリーズに基づいています。特に、個々 のサンプルの回折特性評価アカウント クリスタル ボリューム、フラックスを考慮し、により、結晶が x 線ビーム、それ以降のデータに対して結晶の最高の領域だけを使用するよりも大きいコレクションです。回折データのセットは、最大解像度の最小化された放射線損傷2,3したがって、最適化されています。両方のネイティブおよび単一の波長異常分散 (SAD) データ収集のための擬似ヘリカル (マルチ ポジション) データ収集方法など、要求の厳しいデータ収集プロトコルも使用可能な8です。

山地 1 で完全に自動実験を伴う吹と背骨9で目的の実験的パラメーターを入力ピン希望ビームライン機器規格に適した磁気サンプル マウントの結晶を取り付け、’ 回折計画 ‘ タンパク質結晶構造解析ビームライン (ISPyB)10MX の実験のための web ベースの情報管理システムの統合システムでテーブルし、ビームラインにサンプルを送信します。ESRF ユーザーの Office でサポートされている/ビームラインからのサンプルの輸送のすべての費用、ESRF で (ESRF11詳細についてはウェブサイトを参照してください)。山地-1 に制約はありませんループのサイズまたは結晶の品質。与えられた結晶の回折プランを選択すると、ユーザーことができます既定の設定を使用して、または各サンプル用にカスタマイズすることができます特定のワークフローから選択。いくつかの事前にプログラムされたワークフローがあります。MXPressE3ワークフローのサンプルを含むループは最初光学中心を使用してサンプルの位置に配置されます。その後、中心 X 線ベース クリスタルの最高の領域が x 線ビームに中央揃えされている保証します。データ収集方法は、eEDNA、特にアカウント クリスタル ボリュームとビームライン リアルタイム フラックスを考慮した x 線実験フィールドでオンライン データ解析のプラグイン ベースのアプリケーションを開発するためのフレームワークを使用して計算されます。における回折データ セットのコレクション、次の自動データ処理のパイプラインの12のシリーズを使用してこれを処理し、結果は、ISPyB の検査およびダウンロードのために利用可能な作られています。MXPressE 悲しい3ワークフローはターゲット蛋白質のセレノメチオニン含む結晶を目指しているし、山地 1 の動作エネルギーは Se の K 端のすぐ上という事実を悪用します。悲しいデータ コレクションの MXPressE eEDNA データ収集戦略を最適化するここでは、(すなわち、高い冗長性と Bijvoet のペアの間の Rマージが 5% 以下設定解像度)。一連の後続データ収集せず結晶の回折特性をスクリーンにMXScore3ワークフロー分析結晶の完全な品質評価を生成する使用できます。MXPressI3ワークフローで 0.2 ° 振動を使用して、開始のファイ角度と eEDNA 戦略によって決まる解像度 180 ° 回転データが収集されます。MXPressO3 にはワークフローに preobserved 解像度が含まれています (既定: d分= 2 Å)。結晶化の試みから生じる結晶の初期評価をするためには、 MXPressM3ワークフローを提供しています。高用量のメッシュを実行これにないデータの収集のサンプルのサポートの広い方向にスキャンまたは中心します。最近では、2 つの新しい実験ワークフロー、 MXPressP MXPressP_SAD、pseudohelical のデータ コレクションを実行すると、実装されている8をされています。オンライン、リアルタイムで、すべてのワークフローのすべてのステップの実行を続くことができるユーザーが、ISPyB 経由で。

ここで山地 1 で完全に自動化された MX 実験を準備する方法と実験によるデータ取得、解析する方法を紹介します。例としては、ヒトのミトコンドリア グリシン胸の谷間システム蛋白質 H (GCSH) を使用します。このリポ酸含有タンパク質は、グリ シン開裂系グリシンの低下の責任の一部です。さらにこのシステムには、L 蛋白、リポの脱水素酵素、tetrahydrofolate-を必要とする酵素 T 蛋白質リン酸ピリドキサール グリシンデカルボキシラーゼ P 蛋白が含まれています。GCSH は、T の蛋白質に P 蛋白からグリシンのメチルアミン グループを転送します。H タンパク質の欠陥人間13併発 hyperglycinemia (NKH) の原因であります。

Protocol

注: 生産・精製・結晶化 GCSH の補足ファイル 1で説明します。 1. オフラインの作製と結晶のマウントの概要 ナイロン ループの位置または別の結晶マウント サポートすでに 1 つまたはより多くの結晶の下の背骨ピンに固定され沈殿物液 (0.5 M ナトリウム ギ酸 pH 4.0 + 25 μ l タンパク質溶液の 20 μ L) それらを持ち上げます。 余分な液体を吸う紙芯マウントに触れることによって恐ければ周り大量の液体を削除します。 恐ければに漬凍害溶液析出ソリューション プラス 30% グリセロール;その後、クリスタルのサポートと恐ければの両方を削除します。 余分な液体を吸う紙芯マウントに触れることによって恐ければ周り大量の液体を削除します。 液体窒素で満たされた背骨バイアルにマウントを突入し、同様に準備、欧州分子生物学研究所 (EMBL) の他の結晶と共に、それを保存 ESRF サンプル ・ チェンジャー パック9液体窒素温度で。注: 恐ければは、サブテーマが利用可能になるまでこの状態で安定しています。 2. 山地 1 ビームタイムを要求します。 ESRF ホームページ (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying) での可能な限り早期採択を要求します。注意: ESRF MX ビームラインへのアクセスが可能なモード数があります。研究所は、一部のブロック割り当てグループ (袋)、2 年間着実としてまとめて適用できます。グループは、個別に適用する場合は、ピア レビュー後ビームラインへの迅速なアクセスを可能にするアクセスを圧延の適用できます。グループの提案を見直し・ ESRF 安全グループの詳細を求めることができる人によってクリアされます。提案が承認された場合は、実験番号とパスワードが通知されます。独自のリサーチは、ビームタイムを購入することによって実行できます。 必要な安全研修オンライン (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining) で完了します。 山地-1 カレンダーのビームタイムを予約します。注: それはシフトごとに分析される 50 の試料ホルダーの最大予約することが可能です。 測定は、サンプルのための必要な安全情報と共にメールで実験 (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) を宣言するためのフォームを入力します。 3. ISPyB の回折計画の作成 注: 回折計画 ISPyB のサンプルに必要なすべての情報を保持し、各サンプルの実験に合わせて追加情報を含めることができます。 (Https://exi.esrf.fr/) で ISPyB を開きます。 MX 実験を選択します。 実験番号とパスワードでログインします。 出荷をクリックして |新規追加し必要な情報を提供します。保存をクリックします。 追加区画をクリックし、要求された情報を入力します。保存をクリックします。 アドイン コンテナーをクリックして、名とパックのバーコードを与えるし、脊柱パックを選択します。保存をクリックします。 コンテナー記号および編集ををクリックし、サンプルに関する優先ワークフロー、クリスタル パック等、位置を蛋白質名などの必要な情報を入力します。 ESRF 安全グループによって承認されている蛋白質 (例えば、GCSH またはリゾチーム) を選択します。 それぞれ独立したサンプルを識別するユニークなサンプルの名前を入力します。必要に応じてピンのバーコードをスキャンすることが可能です。以下の情報の残りの部分は省略できます。 オプションの情報を入力します。 それぞれの個別のサンプル実験の種類を入力 (すなわち、MXPressE_SAD、スコア、または MXPressO、等、デフォルト MXPressE) Exp. タイプの下。各結晶を処理に使用する自動ワークフローを定義します。GCSH 結晶が針、 MXPressPを選択します。 知られている場合は、スペース グループ (たとえば、C2、P1 や P212121) を入力します。存在する場合は、データ コレクション戦略計算および使用可能な自動データ処理パイプラインによってこの使用されます。 目的の解像度を入力してください (既定: d分= 2.0 Å)。これは、初期メッシュ スキャン、特性評価、および既定のデータ コレクションのクリスタル-検出器距離を定義します。 この制限をしない回折は結晶からデータセットの完全収集を回避する目的スレッショルド分解能 (1.5 Å や 2.3Å など) を設定します。これは、データ記憶域と分析の時間を節約できます。 必要な完全性を設定 (既定: 0.99)。必要な多重度を設定 (既定: 4). 1 つ以上の結晶は、サンプルのサポートに含まれている場合、は、分析する結晶の最大数を設定します。既定値は 1 または MXPressP のための 5 です。 適切なビーム径を選択 (既定: 50 μ m)。特定の値を選択しない場合、50 μ m のビーム径と X 線中心とデータ収集戦略計算が実行されます。注: 完全なデータのセットのそれに続くコレクション中、梁サイズ適応される自動的に。 スペース グループで言えば強制スペース グループ列で知られています。結晶 (0.5 – 2.0 の既定値は 1 で、高低感度) の放射線感受性を設定します。 必要な場合は、完全なデータセットのコレクションで収集される合計の回転角度を設定 (既定値: eEDNA で決定される総回転角度)。 値を保存します。出荷に戻るをクリックします。ESRF への出荷を送信を押します。 出荷ラベルを印刷して、サンプルを送る。ユーザーは、ESRF アカウントの詳細を使用して、宅配便でピックアップを手配する必要があります。注: サンプル (https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement を参照) のシームレスなリターンを許可する差出人ラベルを含めるを選択する非常に重要です。 4. データの収集、表示、および取得 注: 実験の日、サンプルは中央山塊 1 高容量デュワー (HCD) が転送されます。ビームライン担当者は、ユーザーがリモートで続くことができるデータの収集を起動します。それぞれの別のサンプル タイプのユーザーは、データの収集が開始されたことを知らせる電子メールを受信します。前述のとおり、オンライン、リアルタイムで、すべてのワークフローのすべてのステップの実行を続けることができます、ユーザーを介してISPyB、結果の表示し、ダウンロード元によって。 各サンプルを分析すると、ISPyB (https://exi.esrf.fr/) で自動実験の結果を調べてください。 実験番号とパスワードを使って、ログインし、 ID30A 1で目的の実験的セッションをクリックします。 最寄り (トップ得点) の自動処理パイプライン (たとえば、手榴弾または XDS_APP) を選択し、最後の収集結果をクリックして最高の完全性と最高の解像度正しいスペース グループで書き込まれたデータをダウンロードし、その後、ダウンロードしてください。注: すべてのメッシュ、線、および特性の画像は、それぞれのサンプルは、/MXPressE_01 と呼ばれるサブディレクトリに。ESRF は自動的に EDNA_proc12、手榴弾12、XDS_APP14、autoPROC15XIA216の 5 つの別々 の処理パッケージを実行します。データ統合は、XDS XIA2 ダイヤルに基づいている以外に基づいています。すべてのパッケージはまた悲しいプロトコルを段階的に使用される、データに存在する場合、異常信号の自動検出を許可する異常と nonanomalous モードで実行されます。各パッケージは、さまざまなパラメーターと決定木、いくつかのパッケージ実行特定のサンプルとのより良いことを意味を使用します。ただし、こうするパッケージ及び可能な空間群の数を占めてとき多数の結果のこと。結果では、約解像度と最低解像度シェル、CC(1/2)、および完全性の Rマージなどの他の品質の基準に基づくランク付けされます、したがって。これは最高のデータ セットにユーザーを導くを目指しているが、すべての可能な空間群と結果を慎重に検査する必要があります。 すべてのログ ファイルとマージされていない XDS_ASCII は、ダウンロードしたフォルダーを解凍します。HKL とスケーリングと差し込み印刷の .mtz ファイル。注: 場合閉じる相同物や興味の蛋白質 (PDB 形式) の構造は、実験の開始時に ISPyB にアップロードされた、ESRF で自動処理パイプラインが自動的に実行としてこの構造体を使用して実行分子置換 (氏)、最高の得点のソリューション モデルを検索します。MR パイプラインの結果 ISPyB に表示され、処理されたデータ フォルダー (たとえば、/data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ で見つけることができます。mrpipe_dir/)。ここでは、最終的なモデルの coot1.pdb と反射データ sidechains.mtz 名前なります。パイプラインが解決策を見つけるの可能性を高めるために細胞 (原始細胞減少) の対称性を減らすかもしれないことに注意してください。ここの場合、MR パイプラインは斜方晶系セル (C2221) ではなく単斜晶系セル (C2) に解決策を書いています。分子置換を実行する方法の詳細については、手動で実行 (2 番目の最高得点の自動処理ソリューションの例示)補助ファイルに含まれています。

Representative Results

MXPressP のワークフローは完全に自動的にマウント、x 線ビームの中心、特性評価、および人間 GCSH の結晶のシリーズから完全回折データ セットを収集する ESRF ビームライン山地 1 に使用されました。サンプルがマウントされ、ループが (図 1、左) をスキャンする領域の分析します。回折解析後データ コレクション (図 1右) の結晶内 4 点が選ばれました。その後氏の解決策が発見されたため高品質データセット (表 1) を得られた氏パイプラインを含む自動データ解析パイプラインによって処理します。後者では、急速に得られたデータセットと使用される検索モデル分子置換によって段階的に適しているかどうかを評価するユーザーことができます。さらに、そのこのさらなる分析のための最も有望なデータセットにのみ集中するユーザーを許可、配位子の有無が判断できます。氏によるマニュアルの構造決定は、単一自動絞り込みサイクル (図 2 a) 後に高品質電子密度マップをもたらした。このデータセットの自動パイプラインは Å の分解能; 1.32 でデータをカットただし、ユーザー最高解像度シェルで異なる品質統計 (CC1/2、 Rmeas) に到着、低解像度でデータを削減することができます。人間の GCSH 構造の結晶構造は牛蛋白質 (3KlR) の16のそれに似ています。 連続的な電子密度、N 末端ヒスチジンの札から離れて、全体のアミノ酸鎖に対して表示されます。人間とウシの GCSH を区別する 4 つの置換の 3 が電子密度 (イル ・ Val66、Asp/Glu98、およびルー/Phe149; で容易に識別可能図 2b-d)。これは側鎖の電子密度は、部分的にしか解決する (図 1e) 柔軟性のため Asp/Lys125 切り替えのため不明瞭です。現在得られるモデル、R の動作と 20.4% 23.8% の R無料値がそれぞれ、自動および手動モデル構築と洗練のさらなるサイクルによってさらに最適化することができます。 手榴弾パイプライン XDS_APP パイプライン データの収集と処理 ソースを x 線/ビームライン ESRF/山地-1 波長 (Å) 0.966 解像度 (Å) 41.88-1.48 (1.53-1.48) 41.86 1.32 (1.39-1.32) 合計/ユニークな反射 127670/28644 177332/40134 (12178/2775) (23772/5714) インデックス、スケーリングおよび結合のための空間群 C222 C2221 セルの大きさ a、b、c (Å) 95.85、83.75 42.20 95,82、83.72 42.19 非常 0.05 0.05 R測定(%) 10.0 (110.7) 11.1 (198.2) 9.6 (1.3) 7.6 (0.7) CC1/2 (%) 99.7 (53.9) 99.7 (19.1) 完全性 (%) 99.6 (99.6) 99.5 (98.6) 多様性 4.5 (4.4) 4.4 (4.2) 分子置換と洗練された予備的モデル 段階的に廃止のための空間群 C2 C2221 セルの大きさ a、b、c (Å) 83.74, 42.18 95.82 95,82、83.72 42.19 Α、Β、Γ (°) 90, 90.03, 90 90、90、90 検索モデル氏 (PDB) 3KLR 3KLR タンパク質分子/明日のよいち 2 1 タンパク質残基 250 125 R動作/R無料(%)第 1 改良後 24.3 26.5/ 20.4/23.8 第 1 改良後の RMSD 付着長さ (Å) 0.01 0.01 第 1 改良後 RMSD 結合角 (°) 1.2 1.83 Rotamer 外れ値 (%)第 1 改良後 1.07 4.29 ラマチャンドラン支持/許可/禁止 (%)第 1 改良後 95.93 4.07//0 95.12/4.88/0 表 1: x 線回折データのコレクション、洗練、および検証の統計情報。最高解像度シェルの値はブラケットで与えられます。 図 1: サンプル データ収集の前に解析します。(A) 赤いボックスでを示していますスキャンを選択した地域。(B) 回折像の解析は、ヒート マップとして表示されます。4 つのポジションに位置する結晶内では、データ コレクションに選ばれました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: 精製後に得られる電子密度マップの視覚的検証します。電子密度マップ 2 r.m.s. レベル (、) Trp143 (b) Val66 周り (人間 GCSH のイル) と Glu98 (c) × (人間 GCSH の Asp) と地図で輪郭を描かれる輪郭 r.m.s レベル (d) Phe149 (人間の GCSH のルー) と (e) x 1Lys125 (人間の GCSH の Asp)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

全自動ビームラインは、求められているビームラインまたはリモートで、科学者の存在なし高分子結晶の数が多いから自動特性評価とデータ収集を提供します。完全に自動化されたビームラインを使用すると、手動操作と比較して多くの利点があります。X 線メッシュに基づく例、センタリング、自動サンプルとライン スキャン、実行として人間の目よりもより正確なそれは熱や光の効果によって影響を受けません。確かに、これらのメッシュとライン スキャン提供データ コレクションに使用するビームの正しいサイズを決定する際に重要な追加データ (結晶回折結晶の地域最高のすなわち、詳細寸法)-小さな結晶の特に18-頻繁に得られた回折データの質の改善で起因し、。さらに、研究、実験の成功率をさらに最適化するシステムに合わせて、自動実験のセットアップでユーザー定義のパラメーターを利用して特定のワークフローの手順をカスタマイズできます。

高スループット、および時間を節約できる、ビームライン (ユーザー自己スケジュール カレンダー [上記参照] を使用して)、および山地 1 の完全に自動化されたアプローチに簡単にアクセスを提供、厳密なワークフローの信頼性を一緒に、取る古典的なハンズオン MX 実験とより高度な手順および自動ワークフローを実装する可能性への代わり。近い将来には、x 線中心、結晶脱水実験20などのより複雑なプロトコルは自動化されるの精度を向上させる 3 D19の結晶地図作成を実装予定です。完全自律型のデータ収集は MX、低分子フラグメント画面の高品質なデータを提供する多数の不完全結晶を回折と位相を自動的に提供することのスクリーニングを最適化することで標準的な方法になることを期待しています結晶構造・ デ ・ ノボを解決するために情報。結晶21の自動収穫の動向と組み合わせて、自動サービスとしてのタンパク質結晶構造解析の可能性も現実になる可能性があります。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、ビームライン ESRF をありがとうございます。

Materials

Beamline MASSIF-1 ESRF
BL21DE3 New England Biolabs C2527I
chloramphenicol Roth 3886.1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K Merck Millipore UFC803024
Dialyzing membrane Spectrumlabs 132655
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Dnase Roche 11284932001
DTT Euromedex EU0006-B
EDTA- free protease inhibitors Roche 4,693,159,001
glycerol VWR Chemicals Prolabo 14388.29T
His-trap HP GE healthcare 17-5247-01
imidazole Sigma-Aldrich 56750-500G
IPTG Euromedex EU0008-B
LB medium Sigma-Aldrich L3022
lipoic acid Sigma-Aldrich T5625
loop Hampton Research HR8-124
lysozyme Roche 10 837 059 001
MonoQ 5/50 GL GE healthcare 17-5166-01
NaCl Fisher Chemical S/3160/60
Sonicator vibra cell 75/15 SONICS
SPINE pucks MiTeGen SKU: M-CSM003-0001A
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Sodium Formate Sigma-Aldrich 1064430500
GCSH purification buffer 20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl
GCSH cryo-protection buffer 0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol
Programs:
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Hutin, S., Van Laer, B., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Nurizzo, D., Bowler, M. W. Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules. J. Vis. Exp. (145), e59032, doi:10.3791/59032 (2019).
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