Raccolta di dati dai cristalli delle macromolecole biologiche e completamente autonoma caratterizzazione
Summary
Qui, descriviamo come utilizzare lo screening automatizzato e opzioni di raccolta di dati disponibili presso alcune beamlines di sincrotrone. Scienziati inviare campioni di cryocooled per il sincrotrone e le proprietà di diffrazione sono selezionate, gli insiemi di dati sono raccolti e trattati e, ove possibile, una soluzione di struttura avviene — tutto senza intervento umano.
Abstract
Fasci di raggi x ad alta brillantezza, accoppiati con l’automazione hanno portato all’utilizzo di base di sincrotrone cristallografia macromolecolare (MX) beamlines per anche i progetti più impegnativi in biologia strutturale. Tuttavia, la maggior parte delle strutture ancora richiedono la presenza di uno scienziato in loco per eseguire gli esperimenti. Una nuova generazione di beamlines automatizzato dedicato alla caratterizzazione completamente automatico e della raccolta dati, cristalli di macromolecole biologiche recentemente è stato sviluppato. Questi beamlines rappresentano un nuovo strumento per i biologi strutturali selezionare i risultati di prove di cristallizzazione iniziale e/o la raccolta di un gran numero di insiemi di dati di diffrazione, senza dover controllare la beamline stessi utenti. Qui vi mostriamo come impostare un esperimento per screening automatico e raccolta di dati, come un esperimento viene eseguito presso la beamline, come i set di dati risultanti vengono elaborati, e come, quando possibile, la struttura di cristallo della macromolecola biologica è risolto.
Introduction
Determinazione della struttura tridimensionale delle proteine specifiche è fondamentale in biologia. Le informazioni che derivano dal fare così gettano luce sulla funzione biologica e la forma e la specificità dei siti attivi e/o vincolanti contenute nella molecola oggetto di studio. In molti casi, questo consente meccanismi di azione per essere determinata o, se del caso, potenziali molecole terapeutiche per essere sviluppato. MX è la tecnica più comunemente utilizzata per ottenere informazioni strutturali, ma un collo di bottiglia è la determinazione delle condizioni ottimali per ottenere cristalli ben diffrangano. Pertanto, prove di cristallizzazione sono svolte in numerose condizioni diverse e sono quindi sottoposti a screening, per trovare i migliori cristalli da utilizzare per la raccolta di dati di diffrazione. L’automazione dell’installazione di cristallizzazione prove1 chiaramente ha aiutato in questo senso. Tuttavia, i passaggi successivi (cioè, montaggio di cristallo, lo screening di diffrazione e raccolta di dati di diffrazione) sono solitamente effettuati manualmente, prendendo un sacco di tempo, energie e risorse. L’automazione della raccolta di screening e dati di diffrazione significherebbe, quindi, un enorme guadagno in tempo e di efficienza.
Collezione di screening e dati di diffrazione in MX avviene più spesso a sincrotrone MX beamlines in cui automazione in gran parte ha facilitato questo processo. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, è necessario per lo scienziato di essere presenti presso la beamline durante un esperimento o di utilizzarlo in modalità remota. Recentemente, una nuova generazione di beamlines MX completamente automatizzato è stato sviluppato2. Qui, gli utenti non devono essere presenti, sia fisicamente che in remoto, durante una sessione sperimentale. Questo permette agli scienziati di dedicare più tempo alla meno compiti di routine, piuttosto che trascorrere intere giornate e spesso notti, cristalli di selezione e raccolta dei dati di diffrazione. Prima beamline completamente automatizzata del mondo è il massicciamente automatizzato campione selezione Integrated Facility (MASSIF-1, ID30A-1)2,3 presso la European Synchrotron Radiation Facility (ESRF). Ha un ambiente unico esempio in cui un dewar contenente campione ad alta capacità opera in tandem con un autocampionatore robotico che funge anche da goniometro4,5 della beamline. MASSIF-1 è un ondulatore beamline dotato di un single-photon-counting ibrido pixel detector6, che opera a una lunghezza d’onda fissa di 0,969 Å (12,84 keV) con un intenso fascio di raggi x (2 x 1012 fotoni/s). Le dimensioni di larghezza in corrispondenza della posizione del campione possono essere regolata tra un minimo di 10 µm (fascio rotondo) ad un massimo di 100 µm x 65 µm (orizzontale di dimensioni del fascio verticale). In media, la beamline può elaborare, in modo completamente automatico di moda (Vedi sotto), 120 cristalli in 24h. Il funzionamento della beamline si basa su una serie di flussi di lavoro7, ognuno dei quali prende decisioni intelligenti sulla base del risultato di precedenti passaggi del flusso di lavoro, per garantire la misura ai migliori dati possibili dal campione in studio. In particolare, la valutazione delle caratteristiche di un singolo campione diffrazione prende in flusso e volume di cristallo conto e garantisce, dove il cristallo è più grande il fascio di raggi x, che solo la migliore regione del cristallo è usata per i dati successivi collezione. Insiemi di dati di diffrazione sono, così, ottimizzati per la massima risoluzione con radiazioni ridotto al minimo danno2,3. Protocolli di raccolta di dati complessi, quali strategie di raccolta dati di pseudo-elicoidale (multi-posizione) per la raccolta di dati sia nativo e singolo-lunghezza d’onda anomala diffrazione (SAD), sono inoltre disponibili8.
Coinvolgono gli esperimenti completamente automatici al massiccio-1 cryocooling e i cristalli di montaggio su un Monte campione magnetico adatto per la desiderata beamline dotazione standard pin spina dorsale9, immettere i parametri desiderati sperimentali nella ‘ diffrazione piano ‘ tabella del sistema integrato per la cristallografia di proteine beamlines (ISPyB)10, un sistema di gestione di informazioni basate su web per esperimenti di MX e l’invio di campioni per la beamline. Presso l’ESRF, tutti i costi del trasporto dei campioni da/per la beamline sono supportati dall’ufficio utente ESRF (Vedi il sito Web dell’ ESRF11 per dettagli). Al massiccio-1, non esistono restrizioni sulla dimensione ciclo o qualità di cristallo. Quando si sceglie un piano di diffrazione per un determinato cristallo, l’utente può utilizzare le impostazioni predefinite o scegliere tra flussi di lavoro specifici, che possono essere personalizzati per ogni campione. Diversi flussi di lavoro preprogrammati sono disponibili. Nel flusso di lavoro di3 di MXPressE, il ciclo campione contenente prima è allineato a quella campione utilizzando centraggio ottico. Quindi, basata sul X-ray centratura assicura che la migliore regione del cristallo è centrata per il fascio di raggi x. Strategie di raccolta dati vengono quindi calcolate utilizzando eEDNA, un framework per lo sviluppo di applicazioni basate su plugin soprattutto per analisi dati online nel campo di esperimenti di raggi x, tenendo conto cristallo volume e il flusso in tempo reale presso la beamline. In seguito alla raccolta di un set di dati di diffrazione completo, questo viene elaborato utilizzando una serie di pipeline di elaborazione dei dati automatica12 e i risultati sono resi disponibili per l’ispezione e il download in ISPyB. Il flusso di lavoro di3 MXPressE SADè puntato su cristalli di selenometionina-contenente della proteina dell’obiettivo e sfrutta il fatto che l’energia operativa del MASSIF-1 è appena sopra il bordo Se K. Qui, la strategia di raccolta dei dati di MXPressE eEDNA è ottimizzata per la raccolta dati triste (cioè, alta ridondanza e con la risoluzione impostata a dove il RUnione tra coppie di Bijvoet è inferiore al 5%). Per schermare le proprietà di diffrazione di una serie di cristalli senza raccolta dati successivi, il flusso di lavoro di MXScore3 consente di produrre una valutazione completa qualità dei cristalli analizzati. Del flusso di lavoro di MXPressI3 , 180 ° di dati di rotazione vengono raccolti utilizzando le oscillazioni 0,2 ° e l’angolo iniziale di phi e la risoluzione determinata da una strategia di eEDNA. MXPressO 3 include una risoluzione preobserved nel flusso di lavoro (impostazione predefinita: dmin = 2 Å). Per effettuare una valutazione iniziale dei cristalli risultanti da un processo di cristallizzazione, viene offerto il flusso di lavoro di MXPressM3 . Questo esegue una maglia della alto-dose la scansione sull’orientamento più ampia del supporto del campione con nessuna raccolta di dati o di centraggio. Recentemente, due nuovi flussi di esperimento, MXPressP e MXPressP_SAD, che consentono di eseguire raccolte di dati pseudohelical, sono state implementate8. L’esecuzione di tutti i passaggi in tutti i flussi di lavoro possa essere seguito online e in tempo reale dall’utente, tramite ISPyB.
Qui vi mostriamo come preparare un esperimento MX completamente automatizzato al MASSIF-1 e come recuperare e analizzare i dati risultanti dall’esperimento. Ad esempio, utilizziamo proteine di glicina mitocondriale umano fenditura sistema H (GCSH). Questa proteina contenente dell’acido lipoico è parte del sistema di fenditura della glicina responsabile della degradazione di glicina. Questo sistema inoltre include la proteina P, una decarbossilasi di piridossal fosfato dipendente dalla glicina, la proteina T, un enzima che richiede tetraidrofolato e la proteina di L, una deficit di lipoamide deidrogenasi. GCSH trasferisce il gruppo di metilammina di glicina dalla proteina P alla proteina T. Difetti nella proteina H sono la causa di hyperglycinemia nonketotic (NKH) in esseri umani13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Completamente automatico beamlines fornire raccolta automatizzata di caratterizzazione e dati da un gran numero di cristalli macromolecolari senza la presenza di uno scienziato, o presso la beamline o da remoto, sia necessario. Utilizzando beamlines completamente automatizzato ha molti vantaggi rispetto al funzionamento manuale. Per esempio, l’esempio automatizzata di centraggio, basato sulla maglia di raggi x e linea scansioni, è più preciso di quello eseguito con l’occhio umano come non è influenzato dagli effetti termici o ottici. Infatti, queste scansioni mesh e linea forniscono dati aggiuntivi (vale a dire le dimensioni dettagliate del cristallo e la migliore diffracting regione del cristallo) che sono importanti per determinare la dimensione corretta larghezza da utilizzare per la raccolta dati — soprattutto per piccoli cristalli 18— e spesso si traducono in un miglioramento della qualità dei dati ottenuti diffrazione. Inoltre, sfruttando i parametri definiti dall’utente nell’impostazione degli esperimenti automatici, i passaggi in flussi di lavoro specifici possono essere adattati per soddisfare meglio il sistema in fase di studio, ottimizzando ulteriormente il tasso di successo di esperimento.
Insieme, prendendo l’affidabilità dei flussi di lavoro disponibili, l’accesso diretto ad beamline (utenti self-pianificare, utilizzando un calendario [vedi sopra]) e l’approccio completamente automatico del MASSIF-1 fornisce una rigorosa, ad alta produttività e risparmio di tempo alternativa ai classici esperimenti pratici di MX e il potenziale per implementare le più avanzate procedure e applicazioni nei flussi di lavoro automatici. Nel prossimo futuro, cartografia di cristallo in 3D19 sarà applicata per migliorare la precisione di centratura dei raggi x, mentre protocolli più complessi, ad esempio crystal disidratazione esperimenti20, saranno automatizzati. Si spera che la raccolta dati completamente autonoma diventerà un metodo standard in MX, fornendo dati di alta qualità per gli schermi della piccolo-molecola frammento, la proiezione di un gran numero di mal diffracting cristalli e fornendo automaticamente la fase di ottimizzazione informazioni per risolvere crystal structures de novo. In combinazione con gli sviluppi nella raccolta automatizzata di cristalli21, la possibilità di soluzione di struttura di cristallo della proteina come un servizio automatizzato potrebbe diventare una realtà.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano l’ESRF per valutazione.
Materials
| Beamline MASSIF-1 | ESRF | ||
| BL21DE3 | New England Biolabs | C2527I | |
| chloramphenicol | Roth | 3886.1 | |
| Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K | Merck Millipore | UFC803024 | |
| Dialyzing membrane | Spectrumlabs | 132655 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dnase | Roche | 11284932001 | |
| DTT | Euromedex | EU0006-B | |
| EDTA- free protease inhibitors | Roche | 4,693,159,001 | |
| glycerol | VWR Chemicals Prolabo | 14388.29T | |
| His-trap HP | GE healthcare | 17-5247-01 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-500G | |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B | |
| LB medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| lipoic acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| loop | Hampton Research | HR8-124 | |
| lysozyme | Roche | 10 837 059 001 | |
| MonoQ 5/50 GL | GE healthcare | 17-5166-01 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
| Sonicator vibra cell 75/15 | SONICS | ||
| SPINE pucks | MiTeGen | SKU: M-CSM003-0001A | |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
| Sodium Formate | Sigma-Aldrich | 1064430500 | |
| GCSH purification buffer | 20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl | ||
| GCSH cryo-protection buffer | 0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol | ||
| Programs: | |||
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| MXCube2 | ESRF | Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014). | local development |
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