איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין
Summary
כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש את הסינון האוטומטי ואת אפשרויות של איסוף נתונים זמינים ב beamlines סינכרוטרון מסוימים. מדענים לשלוח דוגמאות cryocooled סינכרוטרון, ואת המאפיינים עקיפה מוקרנים, ערכות הנתונים נאספים וכוח עיבוד ומתבצע, במידת האפשר, פתרון מבנה — כל זאת ללא התערבות אנושית.
Abstract
קרני רנטגן גבוהה-זוהר יחד עם אוטומציה הובילו השימוש beamlines מבוססי סינכרוטרון macromolecular קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן (MX) אפילו הפרוייקטים המאתגרים ביותר בביולוגיה מבנית. עם זאת, רוב מתקני עדיין דורשים את הנוכחות של מדען באתר כדי לבצע את הניסויים. דור חדש של beamlines אוטומטיות המוקדש באופן אוטומטי לחלוטין אפיון, איסוף נתונים, גבישים של מקרומולקולות ביולוגיות פותחה לאחרונה. Beamlines אלה מייצגים כלי חדש לביולוגים מבניים למסך את התוצאות של ניסויים התגבשות ראשונית ו/או האוסף של מספר גדול של ערכות נתונים עקיפה, ללא צורך לשלוט על הפרעות לקרן החלקיקים עצמם משתמשים. הנה אנחנו מראים כיצד להגדיר ניסוי סינון אוטומטי, איסוף נתונים, כיצד ניסוי זה ביצע את הפרעות לקרן החלקיקים, כמה ערכות הנתונים וכתוצאה מכך מעובדים, איך, במידת האפשר, מבנה גבישי של מקרומולקולה הביולוגי נפתרה.
Introduction
קביעת מבנה תלת ממדי של חלבונים ספציפיים חיוני בביולוגיה. המידע נגזרת עושה אז שופך אור על הפונקציה ביולוגי ועל את הצורה וספציפיות של אתרים פעיל ו/או מחייב הכלול המולקולה שנבחנה. במקרים רבים, זה מאפשר מנגנון פעולה כדי לקבוע או, במידת הצורך, פוטנציאל מולקולות טיפולית שפותחה. MX הטכניקה הנפוץ ביותר להשיג מידע מבניים, אבל צוואר בקבוק הוא קביעת התנאים אופטימליים כדי להשיג גבישים diffracting היטב. לכן, התגבשות ניסויים מבוצעים בתנאים שונים רבים, ואז מוקרנים למציאת הקריסטלים הטוב ביותר לשימוש עבור איסוף נתונים עקיפה. האוטומציה של ההתקנה של התגבשות ניסויים1 בבירור עזר בהקשר זה. עם זאת, והשלבים הבאים (קרי, קריסטל הרכבה, הקרנה עקיפה, וגם איסוף נתוני דיפרקציה) בדרך כלל מתבצעות באופן ידני, לוקח הרבה זמן, מאמצים ומשאבים. האוטומציה של ההקרנה עקיפה ואיסוף נתונים, לפיכך, פירושו רווח עצום של זמן ויעילות.
ההקרנה עקיפה ואיסוף נתונים ב- MX מתבצע לרוב ב beamlines סינכרוטרון MX שבו אוטומציה הנחתה במידה רבה את התהליך הזה. עם זאת, ברוב המקרים, זה הכרחי עבור המדען להיות נוכח הפרעות לקרן החלקיקים במהלך ניסוי או להפעיל את זה מרחוק. לאחרונה, דור חדש של beamlines MX אוטומטי לגמרי כבר מפותחת2. כאן, המשתמשים לא צריך להיות נוכח, פיזית או מרחוק, במהלך מפגש ניסיוני. זה מאפשר למדענים מבזבז יותר זמן על פחות משימות שגרתיות, במקום לבלות ימים כולו, ולעתים קרובות לילות והקרנה קריסטלים איסוף נתונים עקיפה. הראשון אוטומטית לחלוטין הפרעות לקרן החלקיקים בעולם היא מאסיבית אוטומטי מדגם הבחירה משולב מתקן (MASSIF-1, ID30A-1)2,3 -מתקן קרינה סינכרוטרון האירופית (ESRF). יש סביבה ייחודית מדגם בהם דיואר לדוגמה, המכיל קיבולת גבוהה פועלת במשולב עם מחליף רובוטי מדגם שפועל גם של הפרעות לקרן החלקיקים מד זווית4,5. מאסיף-1 הוא הפרעות לקרן החלקיקים undulator, מצויד יחיד-פוטון-סופר היברידית פיקסל גלאי6, הפועלת על אורך גל קבוע של 0.969 Å (12.84 קוו) עם קרן רנטגן (2 x 1012 פוטונים/s) אינטנסיבי. ניתן להתאים את גודל קרן במיקום מדגם בין מינימום של 10 מיקרומטר (קרן עגול) למקסימום של מיקרומטר x 65 100 מיקרומטר (אופקי לפי גודל קרן אנכי). בממוצע, הפרעות לקרן החלקיקים ניתן לעבד, באופן אוטומטי לחלוטין אופנה קריסטלים 120 (ראה להלן), ב- 24 שעות. המבצע של הפרעות לקרן החלקיקים מבוססת על סדרה של זרימות עבודה7, שכל אחד מהם לוקח החלטות נבונות בהתבסס על התוצאה של השלבים הקודמים בזרימת העבודה, על מנת להבטיח את המדידה של הנתונים אפשרי בצורה הטובה ביותר מכל המדגם במחקר. בפרט, הערכת המאפיינים עקיפה של דוגמה אישית לוקח בחשבון קריסטל נפח, שטף, ומבטיח, איפה הקריסטל הוא גדול יותר מאשר קרן רנטגן, כי רק האזור הטוב ביותר של הגביש משמש עבור הנתונים הבאים אוסף. ערכות נתונים עקיפה, לפיכך, אופטימיזציה עבור הרזולוציה המרבית עם קרינה ממוזער נזק2,3. תובעניים פרוטוקולים אוסף נתונים, כגון אסטרטגיות אוסף מדומים לוליינית (multi-position) נתונים עבור אוסף נתונים הן מקומיים והן יחיד באורך הגל חריגה עקיפה (SAD) הינם גם זמינים8.
ניסויים אוטומטי לחלוטין על היונגפראו-1 כרוכים cryocooling, הרכבה הקריסטלים על הר מגנטי מדגם מתאים תקן הציוד הרצוי הפרעות לקרן החלקיקים פינס עמוד השדרה9, הזנת הפרמטרים הרצויים ניסיוני ‘ עקיפה תוכנית ‘ שולחן במערכת משולב beamlines (ISPyB) חלבון קריסטלוגרפיה10, מערכת ניהול מידע מבוססות web לניסויים MX, ושליחת הדגימות הפרעות לקרן החלקיקים. -ESRF, כל העלויות של התחבורה של הדגימות של הפרעות לקרן החלקיקים ואליה נתמכים על ידי המשרד משתמש ESRF (ראה באתר האינטרנט של ה ESRF11 לפרטים). ב מאסיף-1, אין הגבלות על גודל לולאה או קריסטל איכות. בעת בחירת תוכנית עקיפה גביש נתון, המשתמש באפשרותך להשתמש בהגדרות ברירת המחדל או לבחור זרימות עבודה מסוימות, אשר יכול להיות מותאם אישית עבור כל דגימה. מספר זרימות עבודה מתוכנת מראש הינם זמינים. בזרימת העבודה של3 MXPressE, הלולאה לדוגמה, המכיל מיושר קודם מיקום הדגימה באמצעות מרכוז אופטי. לאחר מכן, מבוססת על קרני X מרכוז מבטיחה כי האזור הטוב ביותר של הגביש ממורכזת על הקורה צילום רנטגן. אסטרטגיות אוסף נתונים מחושבים ואז באמצעות eEDNA, מסגרת לפיתוח יישומים מבוססי-תוסף במיוחד עבור ניתוח נתונים מקוון בתחום הניסויים רנטגן, לתוך חשבון קריסטל ונפח שטף בזמן אמת-הפרעות לקרן החלקיקים. בעקבות האוסף של ערכת נתונים מלא עקיפה, אז זה מעובד באמצעות סדרה של עיבוד נתונים אוטומטי צינורות12 , התוצאות הופכים לזמינים עבור הורדה, בדיקה ב- ISPyB. MXPressE סאד3 זרימת העבודה מכוונת לגבישים selenomethionine של החלבון היעד, מנצלת את העובדה האנרגיה ההפעלה של מאסיף-1 הוא מעט מעל קצה Se K. . כאן, האסטרטגיה אוסף נתונים eEDNA MXPressE ממוטב עבור איסוף נתונים עצוב (קרי, גבוהה יתירות, ועם הרזולוציה מוגדר איפה Rמיזוג בין זוגות Bijvoet להלן 5%). למסך את המאפיינים עקיפה של סדרה של גבישים ללא איסוף נתונים עוקבות, שזרימת העבודה3 MXScoreיכול לשמש כדי לייצר הערכה באיכות מלאה של הקריסטלים מנותח. בזרימת העבודה של3 MXPressI, 180 מעלות של סיבוב נתונים נאספים באמצעות תנודות 0.2 ° ושימוש הזווית פי המוצא ואת הרזולוציה נקבע על ידי אסטרטגיית eEDNA. MXPressO 3 כוללת רזולוציה preobserved לתוך זרימת העבודה (ברירת מחדל: dדקות = 2 Å). כדי לבצע הערכה ראשונית של הקריסטלים הנובע התגבשות הניסיון, מוצע שזרימת העבודה3 MXPressM. זה מבצע רשת שינוי במינון גבוה לסרוק הכיוון הרחב ביותר של מדגם תמיכה באיסוף נתונים אין או מרכוז. לאחרונה, זרימות שני ניסוי חדש, MXPressP , MXPressP_SAD, ואשר לבצע אוספי נתונים pseudohelical, היו מיושמים8. ניתן בעקבות הביצוע של כל השלבים כל זרימות העבודה באינטרנט, בזמן אמת על-ידי המשתמש, באמצעות ISPyB.
הנה אנחנו מראים כיצד להכין את ניסוי ה-MX אוטומטית לחלוטין על היונגפראו-1 וכיצד לאחזר ולנתח את הנתונים הנובעים הניסוי. לדוגמה, אנו משתמשים אנושיים גליצין מיטוכונדריאלי המחשוף מערכת חלבונים H (GCSH). חלבון זה המכיל חומצה ליפואית היא חלק ממערכת המחשוף גליצין אחראי על ההשפלה של גליצין. מערכת זו נוספת כוללת החלבון P decarboxylase תלויי-פוספט גליצין pyridoxal, החלבון T, אנזים הדורשים tetrahydrofolate, החלבון L, lipoamide דהידרוגנאז. GCSH מעבירה את הקבוצה מתילאמין של גליצין של החלבון P החלבון T. פגמים החלבון H הם הגורם nonketotic hyperglycinemia (NKH) בני13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beamlines אוטומטי לחלוטין לספק אוטומטיות האפיון ואיסוף נתונים ממספרים גדולים של גבישים macromolecular ללא הנוכחות של מדען, את הפרעות לקרן החלקיקים או מרחוק, ונדרשת. שימוש beamlines אוטומטי לגמרי יש יתרונות רבים בהשוואה באופן ידני. לדוגמה, המדגם אוטומטיות מרכוז, המבוססת על רשת הרנטגן, קו סורק, יותר מדויק מאשר לבצע עם העין האנושית כמו זה אינו מושפע אפקטים תרמיים או אופטי. ואכן, אלה סריקות רשת וקו לספק נתונים נוספים (קרי, מידות מפורטת של הקריסטל ואת הטוב ביותר diffracting אזור של הגביש) אשר חשובים בקביעת גודל קרן הנכון כדי להשתמש עבור אוסף נתוני — במיוחד עבור גבישים קטנים 18— לעיתים קרובות לגרום גם שיפור איכות הנתונים עקיפה שהושג. יתר על כן, על ידי ניצול של הפרמטרים המוגדרים על-ידי המשתמש בכיוונון של ניסויים אוטומטיים, התפורות השלבים בזרימות עבודה ספציפיים ולביצועי המערכת שנבחנה, ובכך נוספים מיטוב שיעור ההצלחה בניסוי.
לוקחים ביחד, האמינות של זרימות העבודה זמין, גישה ישירה של הפרעות לקרן החלקיקים (משתמשים עצמית תזמון, באמצעות לוח שנה [ראה לעיל]), ואת הגישה אוטומטית לחלוטין של מאסיף-1 מספק קפדני, תפוקה גבוהה, ואת לחיסכון בזמן אלטרנטיבה קלאסית ניסויים MX על הידיים ואת הפוטנציאל ליישם נהלים ויישומים מתקדמים יותר לתוך זרימות עבודה אוטומטיות. בעתיד הקרוב, קרטוגרפיה קריסטל תלת-ממד19 תיושם כדי לשפר את הדיוק של רנטגן מרכוז, בעוד בפרוטוקולים מורכבים יותר, כגון קריסטל התייבשות ניסויים20, יתבצע באופן אוטומטי. יש לקוות כי איסוף נתונים עצמאי לחלוטין תהפוך שיטה סטנדרטית ב- MX, אספקת נתונים באיכות גבוהה עבור מסכי מולקולה קטנה פרגמנט, אופטימיזציה של ההקרנה של מספרים גדולים של לקוי diffracting קריסטלים ולספק אוטומטית שלב מידע לפתור קריסטל מבנים de novo. בשילוב עם ההתפתחויות קציר אוטומטיות של גבישים21, האפשרות של חלבון קריסטל מבנה הפתרון כשירות אוטומטית יכול גם להפוך למציאות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה על ESRF עבור beamtime.
Materials
| Beamline MASSIF-1 | ESRF | ||
| BL21DE3 | New England Biolabs | C2527I | |
| chloramphenicol | Roth | 3886.1 | |
| Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K | Merck Millipore | UFC803024 | |
| Dialyzing membrane | Spectrumlabs | 132655 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dnase | Roche | 11284932001 | |
| DTT | Euromedex | EU0006-B | |
| EDTA- free protease inhibitors | Roche | 4,693,159,001 | |
| glycerol | VWR Chemicals Prolabo | 14388.29T | |
| His-trap HP | GE healthcare | 17-5247-01 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-500G | |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B | |
| LB medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| lipoic acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| loop | Hampton Research | HR8-124 | |
| lysozyme | Roche | 10 837 059 001 | |
| MonoQ 5/50 GL | GE healthcare | 17-5166-01 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
| Sonicator vibra cell 75/15 | SONICS | ||
| SPINE pucks | MiTeGen | SKU: M-CSM003-0001A | |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
| Sodium Formate | Sigma-Aldrich | 1064430500 | |
| GCSH purification buffer | 20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl | ||
| GCSH cryo-protection buffer | 0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol | ||
| Programs: | |||
| MxCube | Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010) | local development | |
| ISPyB | ESRF | Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 | local development |
| MXCube2 | ESRF | Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014). | local development |
| BES workflow server | Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012). | ||
| DOZOR | ESRF | Bourenkov and Popov, unpublished | local development |
| BLISS beamline control | Guijarro, M. et al. BLISS – Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018). | local development | |
| AUTO processing of images | Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013) | local development | |
| BEST and EDNA | Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009). | local development | |
| CCP4 | Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011). | ||
| Phaser MR | McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007). | ||
| Coot | Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004). | ||
| refmac5 | Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240–255 (1997). | ||
| Matthews | Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968). |
References
- Hui, R., Edwards, A. High-throughput protein crystallization. Journal of Structural Biology. 142 (1), 154-161 (2003).
- Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- Svensson, O., Malbet-Monaco, S., Popov, A., Nurizzo, D., Bowler, M. W. Fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (8), 1757-1767 (2015).
- Cipriani, F., et al. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, 1393-1399 (2012).
- Nurizzo, D., et al. RoboDiff: combining a sample changer and goniometer for highly automated macromolecular crystallography experiments. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (8), 966-975 (2016).
- Bowler, M. W., Svensson, O., Nurizzo, D. Fully automatic macromolecular crystallography: the impact of MASSIF-1 on the optimum acquisition and quality of data. Crystallography Reviews. 22 (4), 233-249 (2016).
- Brockhauser, S., et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).
- Svensson, O., Gilski, M., Nurizzo, D., Bowler, M. W. Multi-position data collection and dynamic beam sizing: recent improvements to the automatic data-collection algorithms on MASSIF-1. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, 433-440 (2018).
- Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
- Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
- Monaco, S., et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).
- Kikuchi, G., Motokawa, Y., Yoshida, T., Hiraga, K. Glycine cleavage system: reaction mechanism, physiological significance, and hyperglycinemia. Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences. 84 (7), 246-263 (2008).
- Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. XDSAPP2.0. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).
- Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
- Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Higashiura, A., et al. High-resolution X-ray crystal structure of bovine H-protein at 0.88 Å resolution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (6), 698-708 (2010).
- Sanishvili, R., et al. A 7 µm mini-beam improves diffraction data from small or imperfect crystals of macromolecules. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (4), 425-435 (2008).
- Bowler, M. W., et al. Diffraction cartography: applying microbeams to macromolecular crystallography sample evaluation and data collection. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (8), 855-864 (2010).
- Bowler, M. W., et al. Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration. Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).
- Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
